CD49f維持宮頸癌干細胞特性的作用研究

馮 倩,趙海鷗,馬紅梅,楊文婷*

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科,西安 710061;2天津市河北區(qū)王串場街社區(qū)衛(wèi)生服務中心;*通訊作者,E-mail:04203031@stu.xjtu.edu.cn)

宮頸癌是全球第六大高發(fā)和致死性癌癥[1]。然而,在發(fā)展中國家,宮頸癌仍是女性第二大高發(fā)和第三大致死性癌癥,而且發(fā)病趨于年輕化。其致死性原因主要為發(fā)現(xiàn)時已失去手術機會的中/晚期和復發(fā)性宮頸癌。腫瘤干細胞是一群具有自我更新、多向分化、無限增殖及極強致瘤性等生物學特性的亞群細胞,同時又由于其所特有的細胞生物學特性,癌基因表達譜和腫瘤微環(huán)境等使其具有極強的抗放化療和轉移侵襲能力,成為臨床放/化療失敗、復發(fā)轉移及最終導致患者死亡的主要原因[2]。

CD49f,即整合素α6(integrin α6),是具有黏附和信號轉導功能的黏附分子整合素家族成員之一,能夠與多種細胞外基質(zhì)蛋白結合,參與細胞的增殖、分化、遷移和黏附等過程[3]。CD49f是包括胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞、造血干細胞和上皮干細胞等干細胞的表面標志[4-6]。近年來,CD49f被證實可作為多種癌癥干細胞的表面標志[7],調(diào)控癌干細胞的增殖、分化和遷移[8-10],其在干細胞培養(yǎng)基富集的宮頸癌細胞腫瘤球中表達增加,提示其可能參與宮頸癌的進展,與宮頸癌干細胞特性的維持相關[11],但并未見研究報道證實。本研究通過流式細胞技術分選獲得CD49fhigh和CD49flow的宮頸癌亞群細胞,研究CD49f在維持體外癌干細胞特性(自我更新能力、分化能力和抗化療藥物等)中的作用,為進一步證實CD49f能夠作為宮頸癌干細胞的表面標記提供前期研究基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

細胞培養(yǎng)液DMEM/High Glucose,Mc Coy’s 5A,RPMI-1640,DMEM/F12和胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司;氨卞青霉素鈉、硫酸鏈霉素和MTT均購自美國Sigma公司;CD49f單克隆抗體和CD49f-FITC流式抗體分別購自美國Abcam公司和BD公司;羊抗鼠免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司;順鉑和5-氟尿嘧啶購自山東齊魯藥業(yè);干細胞培養(yǎng)基相關因子N2,B27購自美國GIBCO公司,EFG和FGF購自美國Peprotech公司;流式細胞計數(shù)儀(BD FACS Aria)購自美國BD公司。

1.2 宮頸癌細胞系及細胞培養(yǎng)

宮頸癌細胞系HeLa,SiHa,C33A,HT-3和CaSki購自ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA),并由本課題組西安交通大學醫(yī)學部環(huán)境與基因相關教育部重點實驗室保存。細胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清,1 000 μg/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM/High Glucose細胞培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)細胞,待單層細胞生長達到80%融合時,用0.25%的胰蛋白酶消化細胞,收集細胞備用。

1.3 生物信息數(shù)據(jù)庫

CD49f轉錄本水平在宮頸癌組織和正常宮頸組織中表達的差異采用腫瘤相關數(shù)據(jù)庫進行分析。GEPIA數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析獲得正常宮頸組織13例,宮頸癌組織305例。GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus)篩選獲得正常宮頸組織36例,宮頸癌組織58例。分別分析CD49f轉錄本水平的表達差異,并進行統(tǒng)計分析。

1.4 免疫細胞化學檢測CD49f蛋白在宮頸癌細胞系中的表達

宮頸癌細胞系HeLa,SiHa,C33A,HT-3和CaSki培養(yǎng)于鋪有80 mm×80 mm爬片的培養(yǎng)皿中,待細胞生長至80%密度后棄培養(yǎng)基,PBS沖洗2次,40 g/L多聚甲醛固定30 min,1 ml/L的Triton X-100室溫孵育20 min。抗原修復采用pH6.0的檸檬酸鈉高壓修復2 min;30 ml/L的H2O2室溫封閉10 min。50 ml/L山羊血清封閉20 min,鼠抗人CD49f單克隆抗體(1 ∶200)4 ℃孵育過夜。次日,PBS沖洗2次,生物素標記羊抗鼠IgG室溫孵育20 min;鏈霉親和素標記的DAB顯色劑顯色,蘇木精復染,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。對照組采用正常小鼠血清替代抗體。

1.5 流式細胞儀檢測CD49f蛋白在宮頸癌細胞系中的表達

將備檢測的細胞進行胰酶消化,PBS清洗2次,調(diào)整細胞濃度至105/ml,CD49f抗體100 μl冰上孵育1 h,預冷的PBS清洗2次,并用濾膜進行過濾,上機檢測或者分選CD49f的表達及所需要的細胞,以小鼠來源的IgG作對照。對于細胞分選,以CD49f陽性上限的5%和陰性下限的5%進行畫門分群,進行分選,并分別定義為CD49fhigh和CD49flow兩群細胞。分選好的細胞直接進行后續(xù)的實驗。

1.6 細胞活力檢測

細胞以1×103濃度接種于96孔板中,連續(xù)7 d檢測細胞活力。細胞經(jīng)0.4%臺盼藍染液染色4-6 h,加入DMSO溶解,在分光光度計波長570 nm測定吸光度并繪制曲線圖。對于藥敏實驗,1×103細胞接種于96孔板過夜貼壁后,將含有不同濃度的化療藥物作用細胞72 h后,檢測細胞活力。順鉑藥物濃度為0,3,6,12 μg/ml,5-氟尿嘧啶濃度分別為0,30,60,120 μg/ml。

1.7 腫瘤球形成實驗

采用含有干細胞因子FGF、EGF、N2和B27的DMEM/F12干細胞培養(yǎng)基進行腫瘤球形成實驗。以每孔1個細胞的數(shù)量分選細胞至9孔板中,用干細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng),每3 d增加20 μl新的培養(yǎng)基,觀察至12-15 d,統(tǒng)計每組細胞腫瘤球形成的數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用t檢驗和One-way ANOVA檢驗分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD49f在宮頸癌中的表達

TCGA數(shù)據(jù)庫和GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示,CD49f轉錄本水平在宮頸癌組織中均一致性地高于正常宮頸組織(見圖1,P<0.05)。免疫細胞化學檢測發(fā)現(xiàn),CD49f蛋白在宮頸癌細胞系HeLa,SiHa,C33A,HT-3和CaSki中均有表達且定位于細胞膜(見圖2)。流式細胞計數(shù)儀結果顯示CD49f在HeLa,SiHa,C-33A,HT-3和CaSki細胞中表達的陽性率分別為90.8%,26.3%,21.7%,19.8%和32.9%(見圖3)。

與正常宮頸組織相比，*P<0.05圖1 GEPIA和TCGA數(shù)據(jù)庫分析CD49f轉錄本水平在宮頸癌和正常宮頸中的表達Figure 1 CD49f mRNA level in cervical cancer and normal cervix by GEPIA and TCGA databases

圖2 免疫組織化學檢測CD49f蛋白在宮頸癌細胞系中的表達 (×1 000)Figure 2 The expression of CD49f protein in cervical cancer cell lines by IHC (×1 000)

圖3 流式細胞技術檢測CD49f蛋白在宮頸癌細胞系中的表達Figure 3 The expression of CD49f protein in cervical cancer cell lines by flow cytometry

2.2 CD49fhigh宮頸癌細胞具有較強的抵抗化療藥的特性

為明確CD49f在宮頸癌惡性生物學行為中的作用,流式細胞技術儀分選獲得CD49fhigh和CD49flow的兩群細胞。MTT實驗結果顯示,CD49f在宮頸癌細胞中表達的高低對細胞增殖能力影響的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見圖4)。CD49f對化療藥物的敏感性的研究顯示,HeLa-CD49fhigh細胞對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性均顯著低于HeLa-CD49flow細胞群,且呈濃度依賴性趨勢。在C33A-CD49fhigh和C33A-CD49flow細胞群中得到同樣的結果(見圖5,P<0.05)。

圖4 MTT實驗檢測親本細胞CD49fhigh和CD49flow細胞亞群的增殖活力Figure 4 Cell viability of parent, CD49fhigh and CD49flow populations detected by MTT assay

與CD49flow比較,*P<0.05圖5 MTT實驗檢測親本細胞CD49fhigh和CD49flow細胞亞群對化療藥的敏感性Figure 5 Sensitivity of parent, CD49fhigh and CD49flow populations to chemotherapeutic drugs by MTT assay

2.3 CD49fhigh宮頸癌細胞具有較強的體外腫瘤球形成能力

有限稀釋法結合體外腫瘤球培養(yǎng)實驗結果顯示,SiHa-CD49fhigh細胞的成球率為10.31%±4.23%,較SiHa-CD49flow細胞的成球率(3.72%±1.03%)顯著增加(P<0.05)。同時,在HeLa和C33A細胞中CD49fhigh細胞群的腫瘤球形成能力亦顯著高于CD49flow細胞群,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)。通過連續(xù)傳代腫瘤球形成實驗檢測兩群細胞的體外自我更新能力,結果顯示,CD49fhigh細胞群在SiHa,HeLa和C33A細胞中第三代腫瘤球形成率分別為(13.28±3.28)%,(26.32±9.21)%和(26.42±8.24)%,均顯著高于CD49flow群細胞的體外成球率[(5.03±2.31)%,(18.34±7.82)%和(18.76±4.23)%],差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6和表1)。

表1 CD49fhigh和CD49flow兩組細胞腫瘤球形成率和自我更新能力的比較

圖6 腫瘤球形成能力和自我更新能力檢測Figure 6 Tumorsphere formation ability and self-renewal ability

2.4 CD49fhigh宮頸癌細胞具有體外分化能力

分選后的細胞進行體外分化培養(yǎng),檢測CD49f蛋白表達的變化,結果顯示,CD49f高表達的宮頸癌細胞SiHa、HeLa和C33A經(jīng)過分化培養(yǎng)3代后,CD49f蛋白的表達明顯降低;連續(xù)傳6代后,CD49f蛋白的表達恢復到親本細胞中CD49f的表達水平(見圖7)。以上結果提示CD49f陽性的宮頸癌細胞具有體外分化能力。

圖7 流式細胞儀檢測分化培養(yǎng)后CD49fhigh細胞群中CD49f蛋白的表達變化Figure 7 The expression of CD49f protein in CD49fhigh cells cultured with differentiation medium by flow cytometry

3 討論

CD49f參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,與癌癥干細胞特性相關。CD49f在前列腺良性和惡性細胞形成的球體中高表達,并且與多種腫瘤細胞的始動相關,包括結腸癌和乳腺癌等[12,13]。此外,在小鼠腫瘤中,CD49f陽性的細胞具有更高的轉移和侵襲能力[14]。因此推測CD49f可能是治療癌癥的有價值的靶點之一。

目前,對宮頸癌干細胞的研究表明,LGR5[15],SOX2[16]和DAX1[17]等均參與了宮頸癌干細胞特性的維持。值得一提的是,HPV18和HPV16作為宮頸癌發(fā)生的必要條件性因子,能夠靶向OCT4,HES1,EGF和TGF-β激活下游干細胞相關信號通路,增加致瘤能力和抑制分化能力[18]。但關于宮頸癌干細胞確切的調(diào)控機制和特異性抗原仍不完全清楚。本研究中,數(shù)據(jù)庫結果顯示CD49f轉錄本水平在宮頸癌組織中顯著增加,提示CD49f在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮促進作用。采用表面標記CD49f分選獲得CD49f高表達和低表達的兩群細胞,分析CD49f的表達對宮頸癌惡性生物學行為的影響和在維持癌干細胞特征中的作用。MTT實驗結果表明CD49f表達的高低與宮頸癌細胞的增殖活力無關,提示CD49f不是通過影響宮頸癌細胞增殖及細胞活力發(fā)揮促癌作用的。因此,我們進一步探索CD49f是否對癌干細胞特征的維持發(fā)揮作用?以往研究已證實癌干細胞具有高致瘤性和自我更新能力,抗分化能力和抗常規(guī)放化療治療等特征。本研究中,CD49fhigh細胞具有比CD49flow細胞更強的自我更新能力和抗分化和化療藥物能力,提示CD49f可能通過調(diào)控宮頸癌干細胞特性的維持發(fā)揮促癌作用。關于CD49f在宮頸癌干細胞中的作用,已有研究表明,HeLa細胞經(jīng)富集培養(yǎng)的腫瘤球中CD49f的表達顯著增加[19],與本研究中的結果是一致的。另外,腫瘤干細胞作為導致腫瘤始動、復發(fā)和轉移的元兇通常被認為與細胞增殖能力包括細胞生長和周期進展無關,也有報道腫瘤干細胞反而具有較非腫瘤細胞較弱的增殖能力[20]。這一點可以很好地解釋CD49f表達的高低與宮頸癌細胞的增殖能力和細胞活力無顯著相關,更加提示CD49f作為宮頸癌干細胞標記的可能性,有望成為宮頸癌干細胞的新標記和靶向治療的潛在新靶點。然而,其在維持宮頸癌干細胞體內(nèi)特征和下游調(diào)控機制的分子機制仍需進一步研究。

綜上,癌干細胞作為腫瘤始動、復發(fā)和轉移的根源,其在腫瘤組織中的轉歸就直接關系患者的預后結局,因此闡明癌干細胞的分子標記和調(diào)控機制對于靶向癌干細胞的治療具有一定的現(xiàn)實意義。對于宮頸癌,尤其是復發(fā)轉移及HPV陰性的宮頸癌患者,研究其干性調(diào)控基因和分子機制,能夠提供有效的預后提示和潛在的治療靶點。