飲料和糖果中5種非法添加色素的檢測

邵仕萍，奚星林，陳潔貞，梁瑞婷

飲料和糖果中5種非法添加色素的檢測

邵仕萍1，奚星林1，陳潔貞2，梁瑞婷1

(1.廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510600；2.廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510600)

采用聚酰胺吸附法提取樣品溶液的色素，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸，用高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定。采用ODS柱分離，以甲醇和硫酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，在520nm波長處檢測。亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的質(zhì)量濃度在1.0～10.0mg/L范圍內(nèi)與其色譜峰面積的線性關(guān)系良好(r=0.999)，在1、2、5mg/kg添加水平時(shí)的平均回收率在82.95%～95.43%范圍內(nèi)，RSD值在1.99%～5.95%范圍內(nèi)。方法檢出限為1.0mg/kg。該方法準(zhǔn)確度高，分離效能好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，適合于飲料和糖果中亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的測定。

高效液相色譜法；亮黑；熒光素鈉；紅色2G；熒光桃紅；孟加拉玫瑰紅

合成色素具有色澤鮮艷、著色力強(qiáng)、色調(diào)多、成本低的特點(diǎn)，故應(yīng)用廣泛。合成色素是以苯、甲苯和萘等化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過一系列有機(jī)反應(yīng)而制成，合成得色素因混有中間產(chǎn)物而具有一定毒性或致癌性。因此，各國對(duì)人工合成色素在食品中允許使用的品種、范圍和添加量作了嚴(yán)格的規(guī)定，GB/T 2760—2007《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》明確規(guī)定在我國允許添加的食用色素的范圍和用量。在歐盟、日本、南非、澳大利亞、新西蘭、加拿大等國和地區(qū)允許在食品中使用亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅等添加劑。熒光素鈉在美國還作為tephritid果蠅的殺蟲劑使用[1-8]，因而在番石榴和咖啡等農(nóng)產(chǎn)品中有殘留的風(fēng)險(xiǎn)。在我國不允許使用上述5種色素，因此研究這些色素的檢測方法對(duì)于保障進(jìn)口食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，國內(nèi)外已有分別測定食品和土壤中熒光素鈉、紅色2G和亮黑的文獻(xiàn)報(bào)道[9-15]，食品中亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅同時(shí)檢測未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究上述5種色素的同時(shí)檢測，用聚酰胺吸附法提取飲料和糖果中的色素，用反相高效液相色譜檢測，旨在為其在食品中的檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

檸檬茶飲料、果酒和硬糖 市購。

熒光桃紅(純度95%)、孟加拉玫瑰紅(純度95%)、紅色2G(純度95%)、亮黑(純度95%)、熒光素鈉(純度95%) 美國Sigma公司；聚酰胺(80～120目)；層析柱 自制。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品(100±0.1)mg，置于100mL容量瓶中，用少量甲醇-水(體積比1:1)溶液溶解，并用甲醇定容至刻度，混勻，該溶液質(zhì)量濃度為1mg/mL；標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋配制成1.0、3.0、5.0、7.0、10.0mg/L系列工作溶液。

2695e 高效液相色譜系統(tǒng)(帶2998二極管陣列檢測器和Empower 色譜信息管理系統(tǒng)) 美國Waters公司；TurboVap LV恒溫氮吹裝置 美國Zymark公司；MS3振蕩機(jī) 德國IKA公司。

1.2 樣品處理

1.2.1 飲料和酒類

取樣10.0～20.0g，加熱驅(qū)除二氧化碳和乙醇，冷卻。用檸檬酸溶液調(diào)樣品液pH值到6，水浴加熱至60℃。1.2.2硬糖、淀粉軟糖

稱取5.00～10.00g粉碎試樣，放入100mL燒杯中，加水30mL，溫?zé)崛芙?。用檸檬酸溶液調(diào)樣品液pH6，水浴加熱至60℃。

1.2.3 凈化步驟

將20g聚酰胺粉加入到適量pH4、60℃左右的水中，注入層析柱中，使聚酰胺分布均勻密實(shí)。將上述樣品溶液注入到層析柱中，用60℃、pH4的水20mL分別淋洗3次，用乙醇-氨水-水(7:2:1)溶液解吸，直至洗脫液無色。收集解吸液，在水浴上蒸發(fā)至近干，用甲醇-水(1:1)溶液溶解，定容至5mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，取10μL注入高效液相色譜儀分析。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Ultimate C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.02mol/L乙酸銨溶液，流速：1.0mL/min，梯度洗脫程序見表1；柱溫：35℃；檢測波長：520nm；進(jìn)樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program

1.4 測定方法

配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中待測物響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。再將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定。以待測物色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，與其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時(shí)以二極管陣列檢測器記錄待測物的光譜圖，并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇

亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅色譜峰的最大吸收波長分別為572、491、510、547、557nm。兼顧檢測的適用性和檢測靈敏度要求，選擇520nm為檢測波長。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

固定檢測波長，分別考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙酸銨溶液、乙腈-乙酸銨溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)于待測物的色譜峰形的影響。

結(jié)果表明，采用甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)，待測物幾乎不出峰。以乙酸銨為離子對(duì)試劑，采用甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，待測物的色譜峰形最好，而且隨著甲醇比例的增加，流動(dòng)相的極性逐漸減小，洗脫能力逐漸增強(qiáng)，兼顧到合適的保留時(shí)間和良好的色譜峰形，以及試樣中還有眾多脂溶性成分需要洗脫，最終選擇甲醇初始比例為35%，進(jìn)行梯度洗脫，不僅把熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅色分離開，而且檢測時(shí)間也可以接受。

2.1.3 柱溫的選擇

在檢測波長和流動(dòng)相固定以后，對(duì)不同的柱溫(15～40℃)進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)柱溫35℃時(shí)，待測物的保留時(shí)間和色譜峰形最為理想。

2.1.4 色譜柱的選擇

在檢測波長、流動(dòng)相及柱溫固定的情況下，分別考察Kromasil C18、Sulpeco C18、Ultimate 等不同固相色譜柱條件下待測物的色譜峰形。結(jié)果表明，采用Ultimate C18作為色譜柱，色譜峰形最為尖銳。

2.2 工作曲線及方法的檢出限

根據(jù)本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件，取1.0、2.0、2.5、5.0、7.5、10.0mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)溶液注入色譜儀中，混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。待測物質(zhì)量濃度在1.0～10.0mg/L范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的峰面積值呈良好線性關(guān)系，見表2。當(dāng)樣品中的待測物超過此線性范圍時(shí)，可適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。

表2 5種色素的線性方程和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients for the determination of 5 kinds of colorants

按RSN=3計(jì)算，方法的檢出限為1.0mg/kg。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards

2.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

在上述優(yōu)化條件下，以未檢出本底的飲料、糖果做基質(zhì)，測定了1、2、5mg/kg添加水平時(shí)各色素的回收率，每個(gè)添加水平重復(fù)6次測定，結(jié)果見表3、4。

表3 飲料中5種色素的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 3 Recovery rates for 5 kinds of colorants in drink spiked at three levels

表4 糖果中5種色素的加標(biāo)回收率結(jié)果(n=6)Table 4 Recovery rates for 5 kinds of colorants in candy spiked at three levels

表3、4表明，亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的加標(biāo)平均回收率在82.95%～95.43%范圍內(nèi)，RSD在1.99%～5.95%范圍內(nèi)，回收率和精密度滿足實(shí)驗(yàn)需要。

3 結(jié) 論

本研究建立了飲料和糖果中亮黑、熒光素鈉、紅色2G、熒光桃紅和孟加拉玫瑰紅的液相色譜檢測方法，該方法簡便、快速、結(jié)果穩(wěn)定可靠，檢測限、回收率和精密度均符合殘留分析要求，可應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測。

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Determination of 5 Kinds of Illegally-added Colorants in Drink and Candy

SHAO Shi-ping1，XI Xing-lin1，CHEN Jie-zhen2，LIANG Rui-ting1
(1. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510600, China；2. College of Public Health, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510600, China)

A quantitative determination method for Brilliant Black PN, Fluorescein Sodium, Red 2G, Phloxine B and Rose Bengal in drink and candy was established using high performance liquid chromatography (HPLC). For sample preparation, extraction by polyamide adsorption and desorption with ethanol-ammonia solution-water (7:2:1, V/V) were carried out. An ODS C18column (250 mm × 4.6 mm, 5μm) was used for chromatographic separation, which was eluted with methanol-0.02 mol/L ammonium acetate aqueous solution as mobile phase at 35 ℃. The linear range of the developed method was 1.0-10.0 mg/L with relative standard deviation of 1.99%-5.95% and the detection limit was 1.0 mg/kg. The average recovery rates were 82.95%-95.43%. This method is simple, accurate, and suitable for the determination of these illegally-added colorants in drink and candy.

HPLC；brilliant black PN；fluorescein sodium；red 2G；phloxine B；rose bengal

O657.72

A

1002-6630(2011)04-0189-04

2010-04-06

中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2009JK011)

邵仕萍(1980—)，女，工程師，本科，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?、食品污染物檢測。E-mail：shaoshiping@sohu.com