藍(lán)色小麥游離酚和結(jié)合酚的綜合提取及紅外光譜分析

王彩霞 劉富明 郭靜雨 徐 瑤 涂媛媛 李 誠(chéng)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院1，雅安 625014)(屏山縣市場(chǎng)監(jiān)督管理局2，宜賓 645350)

多酚是一類具有廣泛生物活性的植物次生代謝物，其活性包括抗氧化、抑菌、抗癌和保護(hù)心血管等[1, 2]。小麥多酚含量豐富，許多學(xué)者對(duì)普通小麥多酚的提取及活性做過(guò)深入研究[3, 4]，而花色苷含量更豐富的彩色小麥卻少有研究。藍(lán)色小麥富含花色苷，多酚含量和抗氧化活性高于紫色及普通小麥，是天然多酚的良好來(lái)源[5]。

多酚在植物體內(nèi)的存在形式通常有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種，目前對(duì)植物多酚的提取，絕大多數(shù)僅針對(duì)游離酚，而以結(jié)合形式存在的多酚，因不能直接被有機(jī)溶劑萃取，常被忽略，這不僅使所提取的多酚總量低于實(shí)際值，也低估了多酚的營(yíng)養(yǎng)和應(yīng)用價(jià)值。小麥中的酚類絕大多數(shù)以結(jié)合態(tài)形式存在，其結(jié)合酚的抗氧化活性高于游離酚[5, 6]。開(kāi)展藍(lán)色小麥游離酚和結(jié)合酚綜合提取方法的研究，對(duì)于全面評(píng)價(jià)藍(lán)色小麥多酚的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要意義，也可為藍(lán)色小麥資源的開(kāi)發(fā)和深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)色小麥(蜀藍(lán)麥1701)，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供，粉碎后過(guò)100目篩備用；無(wú)水乙醇、H2SO4、乙酸乙酯、福林酚：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan Flash酶標(biāo)儀，Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀。

1.3 藍(lán)色小麥多酚提取

1.3.1 基本提取工藝

游離酚的提取參考向莉[7]方法并做適當(dāng)修改：藍(lán)色小麥粉中加入乙醇溶液，于超聲功率240 W條件下提取游離酚，超聲提取2次。提取液經(jīng)真空濃縮、凍干后得到游離酚。

結(jié)合酚的提取參考楊希娟等[8]的方法并做適當(dāng)修改：將提取游離酚后的藍(lán)色小麥殘?jiān)占?，加入正己?液料比20 mL/g)，振蕩3 min，離心，棄上清液。殘?jiān)尤際2SO4溶液水浴，冷卻后用乙酸乙酯萃取(每次萃取液料比20 mL/g，萃取4次)結(jié)合酚。萃取相經(jīng)真空濃縮，凍干后得到結(jié)合酚。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以游離酚提取量為指標(biāo)，考察乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%)、液料比(10、15、20、25、30 mL/g)、超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)和超聲溫度(40、50、60、70、80 ℃)對(duì)游離酚提取效果的影響。

以結(jié)合酚提取量為指標(biāo)，考察H2SO4濃度(5%、10%、15%、20%、25%)、液料比(10、15、20、25、30 mL/g)、水浴時(shí)間(30、40、50、60、70 min)和水浴溫度(60、65、70、75、80 ℃)對(duì)結(jié)合酚提取效果的影響。

1.3.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)提取效果影響較大的三個(gè)因素，采用Box-Behnken模型，以游離酚和結(jié)合酚提取量為指標(biāo)，確定最優(yōu)提取工藝。

1.4 多酚含量測(cè)定

福林酚法[9]。

1.5 傅里葉紅外光譜分析

參照萬(wàn)山等[10]的方法略改：將樣品置于紅外光譜儀中測(cè)定。掃描分辨率為4 cm-1，掃描波數(shù)范圍為4 000～450 cm-1，掃描次數(shù)為32。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS19.0、Design-Expert 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 乙醇/H2SO4濃度對(duì)藍(lán)色小麥游離酚/結(jié)合酚提取效果的影響

乙醇濃度對(duì)藍(lán)色小麥游離酚提取的影響如圖1所示：藍(lán)色小麥游離酚提取量隨乙醇濃度的增大先升高后降低，60%時(shí)達(dá)到最大，這可能與藍(lán)色小麥中游離酚的極性有關(guān)，60%的乙醇溶液和藍(lán)色小麥游離酚的極性更接近，游離酚與乙醇的結(jié)合作用強(qiáng)，游離酚溶出量高，而當(dāng)乙醇濃度高于60%后，提取溶劑極性降低，使得水溶性游離酚的溶解能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致游離酚得率降低。Branimir等[11]利用乙醇從薄荷中提取多酚的研究也認(rèn)為乙醇濃度是決定游離酚提取效果的重要因素。

結(jié)合酚多為多酚與細(xì)胞壁物質(zhì)、多糖類物質(zhì)結(jié)合形成，因此需先經(jīng)水解使細(xì)胞壁等物質(zhì)與多酚分離后再萃取[12]。本研究采用適當(dāng)濃度的H2SO4進(jìn)行水解，H2SO4濃度對(duì)藍(lán)色小麥結(jié)合酚提取量的影響如圖1所示：與游離酚相同，結(jié)合酚的提取量隨H2SO4濃度的升高先增大后降低，當(dāng)硫酸濃度為10%時(shí)，藍(lán)色小麥結(jié)合酚提取量達(dá)到最大值。馮悅等[13]在提取紫薯結(jié)合酚時(shí)也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，這可能是因?yàn)樵?%～10%范圍內(nèi)H2SO4濃度的增加促進(jìn)了糖苷鍵的斷裂利于結(jié)合酚的釋放，而 H2SO4濃度超過(guò)10%會(huì)使釋放出來(lái)的結(jié)合酚被破壞分解，造成結(jié)合酚提取量降低。

圖1 乙醇/H2SO4濃度對(duì)游離/結(jié)合酚提取效果的影響

2.1.2 液料比對(duì)藍(lán)色小麥游離酚/結(jié)合酚提取效果的影響

液料比是影響多酚提取的重要因素，溶劑過(guò)少，提取不充分，溶劑過(guò)多，不僅增加成本、加大溶劑回收難度，對(duì)提取效果也有一定影響。如圖2所示，提高液料比，在一定程度上可以提升藍(lán)色小麥游離酚的提取量，但當(dāng)液料比超過(guò)20 mL/g后游離酚的提取量開(kāi)始下降，分析其原因可能是過(guò)多的溶劑增加了提取過(guò)程中的熱負(fù)荷，增大了濃縮能耗，造成了酚類物質(zhì)的分解。Zoran等[14]的研究也證實(shí)液料比過(guò)高不利于多酚的提取。

當(dāng)液料比在10～15 mL/g之間時(shí)，藍(lán)色小麥結(jié)合酚的得率隨液料比加大而升高，而當(dāng)液料比超過(guò)15 mL/g后，結(jié)合酚的得率隨著液料比的加大開(kāi)始下降。液料比升高，H2SO4的絕對(duì)含量增大，過(guò)多的酸不僅能水解糖苷鍵，也會(huì)降解結(jié)合酚，造成總酚含量下降[15]。王婧等[16]利用H2SO4水解糖苷鍵提取結(jié)合酚的研究也發(fā)現(xiàn)，溶劑比例過(guò)高導(dǎo)致結(jié)合酚的提取量下降。

圖2 液料比對(duì)游離/結(jié)合酚提取效果的影響

2.1.3 超聲/水浴時(shí)間對(duì)藍(lán)色小麥游離酚/結(jié)合酚提取效果的影響

超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)能形成局部高壓，加速細(xì)胞壁破裂，提高提取效率[17]。超聲波作用于物料的時(shí)間對(duì)多酚的提取影響較大：超聲時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞較少，酚釋放不充分，多酚提取率低；超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一方面累積的超聲能量可能會(huì)破壞多酚的結(jié)構(gòu)，另一方面酚類在空氣中暴露時(shí)間越長(zhǎng)，被氧化的概率越大，造成多酚提取率下降[18]。如圖3所示，在5～15 min范圍內(nèi)，延長(zhǎng)超聲處理時(shí)間能有效提升藍(lán)色小麥游離酚的提取量，但超聲提取時(shí)間超過(guò)15 min，游離酚量開(kāi)始下降，時(shí)間越長(zhǎng)，下降越多。

60 min之前，隨水浴時(shí)間延長(zhǎng)，結(jié)合酚提取量快速增加，這表明水解時(shí)間延長(zhǎng)有利于糖苷鍵的斷裂，但水解超過(guò)60 min，結(jié)合酚提取量開(kāi)始降低。王振宇等[19]也認(rèn)為水解時(shí)間應(yīng)適宜，過(guò)短不能使結(jié)合酚與相連的化學(xué)鍵完全斷裂，過(guò)長(zhǎng)會(huì)使已釋放的結(jié)合酚被降解，雜質(zhì)大量溶出，不利于結(jié)合酚提取。

圖3 超聲/水浴時(shí)間對(duì)游離/結(jié)合酚提取效果的影響

2.1.4 超聲/水浴溫度對(duì)藍(lán)色小麥游離酚/結(jié)合酚提取效果的影響

如圖4所示，適當(dāng)提高超聲提取溫度有利于藍(lán)色小麥游離酚的提取，這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)母邷乜梢约铀俜宇愇镔|(zhì)的擴(kuò)散速度，使其更易從原料中浸出。本研究中當(dāng)超聲提取溫度為50 ℃時(shí)游離酚提取量升至最高點(diǎn)，此后繼續(xù)升溫，提取量逐漸降低，這可能是由于溫度過(guò)高導(dǎo)致酚發(fā)生降解或溫度過(guò)高引起乙醇的大量揮發(fā)所致。Teh等[18]也指出盡管升高溫度可以提升超聲波的空化效應(yīng)，加速細(xì)胞結(jié)構(gòu)的崩解，加快酚類的溶出，但過(guò)高的溫度也會(huì)引起溶劑中多酚的分解。

從圖4可看出，在40～75 ℃范圍內(nèi)，增加水浴溫度可明顯提高結(jié)合酚的提取量，但水浴溫度不宜超過(guò)75 ℃，因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)引起酚類物質(zhì)的分解，導(dǎo)致提取量下降，因此在實(shí)際操作中選擇75 ℃。盧婉容等[20]利用酸法提取木瓜皮中的結(jié)合酚，也認(rèn)為水解溫度過(guò)高反而會(huì)導(dǎo)致提取率下降。

圖4 超聲/水浴溫度對(duì)游離/結(jié)合酚提取效果的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 模型檢驗(yàn)方差分析

對(duì)提取藍(lán)色小麥游離酚的乙醇濃度，液料比及超聲時(shí)間進(jìn)行進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化，提取結(jié)果如表1所示，方差分析結(jié)果如表2所示。游離酚提取量與各因素間的二元回歸方程為：Y=1 065.60+6.13A-1.75B+5.38C-0.50AB+4.25AC+0.000BC-26.43A2-19.68B2-15.42C2。由方差分析可知，游離酚提取的響應(yīng)面模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著, 表明該回歸模型擬合性能良好，準(zhǔn)確性高，可反映優(yōu)化提取效果。方程一次項(xiàng)A、C，交互項(xiàng)AC，二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，一次項(xiàng)B影響顯著。三個(gè)因素對(duì)游離酚提取量的影響大小為：乙醇濃度>超聲時(shí)間>液料比。

將提取藍(lán)色小麥結(jié)合酚的液料比、水浴溫度和水浴時(shí)間采用響應(yīng)面優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，方差分析結(jié)果見(jiàn)表2。三因素對(duì)結(jié)合酚提取量影響的二元回歸方程為：Y1=1134.00+0.62A1-0.88B1+1.75C1+2.50A1B1+3.25A1C1+0.75B1C1-8.00A12-6.00B12-5.75C12。由方差分析可知，結(jié)合酚提取的響應(yīng)面模型極顯著，失擬項(xiàng)P>0.05，擬合良好。方程一次項(xiàng)C1對(duì)結(jié)合酚提取量影響顯著，交互項(xiàng)A1B1、A1C1和所有二次項(xiàng)對(duì)結(jié)合酚提取量影響極顯著。對(duì)結(jié)合酚提取量的影響，三個(gè)因素的排序依次為：水浴時(shí)間>水浴溫度>料液比。

表1 游離酚/結(jié)合酚提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 游離酚/結(jié)合酚提取回歸方程方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互效應(yīng)分析

如圖5a所示，當(dāng)游離酚提取的料液比取零點(diǎn)值時(shí)，乙醇濃度和超聲時(shí)間兩者之間交互作用的等高線為橢圓形，交互作用顯著。分別固定超聲時(shí)間和乙醇濃度，游離酚提取量隨乙醇濃度和超聲時(shí)間增加均先升高后降低，說(shuō)明控制好乙醇濃度和加超聲時(shí)間對(duì)游離酚的提取至關(guān)重要，這與方差分析結(jié)果一致。

結(jié)合酚提取的響應(yīng)面交互分析如圖5b和圖5c所示，料液比和水浴溫度，液料比和水浴時(shí)間之間交互作用的等高線均為橢圓形，交互作用顯著。分別固定水浴溫度和液料比，結(jié)合酚提取量隨液料比和水浴溫度增大均先升高后降低；分別固定水浴時(shí)間和液料比，結(jié)合酚提取量也隨液料比和水浴時(shí)間提高均先增大后減小。

2.2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證

響應(yīng)面分析得到游離酚最佳提取參數(shù)為：乙醇濃度61.31%、液料比19.68 mL/g、超聲時(shí)間15.65 min，模型預(yù)測(cè)的游離酚提取量為(1 057.0±4.3)μg/g。為方便操作，實(shí)際設(shè)置參數(shù)為：乙醇濃度60%、液料比20 mL/g、超聲時(shí)間15 min，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的游離酚提取量為(1 066.0±2.7) μg/g。驗(yàn)證與預(yù)測(cè)結(jié)果十分接近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)選的條件可靠。

圖5 各交互作用對(duì)游離酚/結(jié)合酚提取的響應(yīng)面圖

模型預(yù)測(cè)得出結(jié)合酚提取最優(yōu)條件是：液料比15.33 mL/g、水浴溫度74.78 ℃、水浴時(shí)間61.23 min，此條件下預(yù)測(cè)結(jié)合酚提取量可達(dá)到(1 128.0±4.7) μg/g。實(shí)際調(diào)整參數(shù)為液料比15 mL/g、水浴溫度75 ℃、水浴時(shí)間60 min進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)合酚(1 134.0±5.6) μg/g，與理論預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)選的提取條件可靠。

2.3 傅里葉紅外光譜分析結(jié)果

圖6 藍(lán)色小麥游離/結(jié)合酚的傅里葉紅外光譜圖

3 結(jié)論

本研究先對(duì)藍(lán)色小麥中的游離酚進(jìn)行提取，提取工藝為：乙醇濃度60%、液料比20 mL/g、超聲功率240 W、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間15 min、提取2次，游離酚提取量為(1 066.0±2.7) μg/g。之后繼續(xù)從殘?jiān)刑崛〗Y(jié)合酚，提取條件是：H2SO4濃度 10%、液料比15 mL/g、水浴溫度 75 ℃、水浴時(shí)間 60 min、乙酸乙酯萃取 4 次，結(jié)合酚提取量可達(dá)(1 134.0±5.6) μg/g。紅外光譜分析證實(shí)提取的游離酚和結(jié)合酚樣品中含有多酚類化合物的典型基團(tuán)。與傳統(tǒng)僅用有機(jī)溶劑提取游離酚的方式相比，本研究將藍(lán)色小麥多酚的提取量提高了51.5%。