淡豆豉多糖及其酶解產物的理化性質和抗氧活性研究

李朋月 朱艷蘋 國旭丹 景永帥 鄭玉光 吳蘭芳

(河北中醫(yī)學院1，石家莊 050200)(河北省中藥炮制技術創(chuàng)新中心2，石家莊 050200)(河北科技大學3，石家莊 050018)

淡豆豉為豆科植物大豆Glycinemax(L.) Merr.成熟種子的發(fā)酵加工品，具有良好食用及藥用價值，可治療感冒、寒熱頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠的癥狀[1]。淡豆豉中含有大豆異黃酮、多糖等活性成分[2]，多糖是由醛基和酮基通過苷鍵連接的高分子聚合物，目前已經有100多種植物多糖被分離出來應用于臨床[3]。

研究表明，經過酶解后的多糖生物活性得到了明顯提高。鄭嵐等[4]通過體外抗氧化實驗表明，經纖維素酶、蝸牛酶和硫酸水解的干巴菌多糖的抗氧化能力顯著增強。多糖酶解主要是通過改變多糖分子質量、分子結構、黏度及取代基的種類、數量和位置以實現(xiàn)其理化性質的改變、生物活性的增強甚至獲得新的生物活性[5]；據文獻報道，植物多糖具有廣泛的生物活性，并表明多糖作為抗氧化劑具有獨特的優(yōu)勢[6]。目前鮮見淡豆豉多糖進行纖維素復合酶酶解等的相關報道。

本研究主要對淡豆豉多糖進行提取，利用纖維素復合酶進行修飾，并測定淡豆豉多糖及其纖維素復合酶酶解產物的性質及抗氧化活性，以期為淡豆豉多糖及多糖類成分的修飾和淡豆豉活性成分的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡豆豉、纖維素復合酶：食用級；牛血清蛋白、DPPH、Trolox、AAPH、FL、考馬斯亮藍：分析純。

1.2 主要儀器與設備

TH-500型梯度混合器，BT-100B型數顯恒流泵；UV-2550型紫外分光光度儀，3020-425型多功能微孔板讀數儀，1260型高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 淡豆豉預處理

取淡豆豉，粉碎，過40目篩，用95%乙醇回流提取2 h，除去脂溶性成分，藥渣干燥后，備用。

1.3.2 淡豆豉多糖的提取

取除脂后的淡豆豉粉末，加入20倍體積的蒸餾水提取，在超聲波輔助的條件下，55 ℃恒溫提取22 min，離心取上清液。淡豆豉殘渣重復提取1次，合并濾液。將濾液減壓濃縮至一定體積，使用終濃度為80%的乙醇沉淀，抽濾，濾渣揮去酒精后冷凍干燥，得到淡豆豉粗多糖(SSPP)。

1.3.3 淡豆豉多糖的酶解

采用恒溫搖床法進行酶解，精密稱取2 g淡豆豉多糖，放入具塞錐形瓶中，加純水攪拌至溶解，調pH至中性，加12%的纖維素復合酶至溶解，在55 ℃恒溫搖床中反應1 h。

反應后沸水浴滅活10 min，離心，取上清液用終濃度為80%乙醇進行醇沉，4 ℃靜置24 h，抽濾，濾渣揮去酒精后冷凍干燥，得到纖維素復合酶酶解產物SSPP-E。

1.3.4 淡豆豉多糖及其酶解產物糖含量的測定

采用硫酸-苯酚法測定可溶性總糖含量。參照文獻[7]方法進行適當改進制定標準曲線，并按該方法在490 nm處測定樣品的吸光度值，并代入標準曲線計算可溶性糖含量[8]。

1.3.5 淡豆豉多糖及其酶解產物蛋白質含量的測定

參照文獻利用考馬斯亮藍法測定SSPP及SSPP-E中蛋白質含量[8]。

1.3.6 淡豆豉多糖及其酶解產物的紫外-可見光譜分析

精確稱取SSPP及SSPP-E樣品各1.0 mg，用少量蒸餾水溶解，定容至10 mL的容量瓶中，使其配成質量濃度為0.1 mg/mL的多糖溶液，在200～800 nm波長處進行掃描[9]。檢測多糖中是否具有核酸和蛋白質的特征吸收峰。

1.3.7 淡豆豉多糖及其酶解產物的紅外光譜分析

精確稱取1.0 mg的SSPP及SSPP-E樣品，以KBr混合研磨成極細粉末，壓片，在4 000～400 cm-1范圍內進行紅外光譜掃描[10]。檢測樣品中是否存在多糖的特征吸收峰。

1.3.8 淡豆豉多糖及其酶解產物的單糖組成分析

參照文獻對淡豆豉多糖及其酶解產物的單糖組成進行測定[11,12]。

1.3.9 淡豆豉多糖及其酶解產物的抗氧化活性測定

1.3.9.1 DPPH活性的測定

參照Karagozler A A等[13]的方法。

1.3.9.2 羥基自由基的測定

參考許效群等[14]方法。將每個樣品濃度平行測定3次，計算平均值，通過式(1)計算清除率：

(1)

式中：K為清除率/%；A1為多糖樣品的吸光度；A2為本底吸光度；A0為空白對照的吸光度。

1.3.9.3 ORAC的測定

參考Lin Lianzhu等[15]方法進行測定。ORAC實驗需要設定兩種對照，即沒有添加AAPH的FL熒光自然衰減對照和沒有抗氧化劑存在時的AAPH作用對照。

樣品的抗氧化能力與自由基作用下熒光衰退曲線的延緩部分面積(Net AUC)直接相關[16]，計算ORAC值。

(2)

2 結果

2.1 淡豆豉多糖的提取率

除脂后的淡豆豉粉末經超聲波輔助水提后，用乙醇沉淀，沉淀干燥得到淡豆豉粗多糖(SSPP)，提取率為4.59%。

2.2 淡豆豉多糖的酶解得率

取2 g的SSPP通過纖維素復合酶進行恒溫搖床酶解，得到SSPP-E，酶解得率為58.0%。

2.3 可溶性總糖含量測定

以葡萄糖做標準品，通過曲線得回歸方程為y=12.1x+0.151 6 (R2=0.992 7)，通過計算可得，SSPP和SSPP-E可溶性總糖含量分別為68.88%和55.08%。

2.4 蛋白含量的測定

以牛血清蛋白做標準品，得方程y=7.312 9x+0.703 5 (R2=0.992 0)，SSPP和SSPP-E的蛋白含量分別為4.03%和0.19%。

2.5 紫外-可見光譜分析

由圖1可知，吸收峰主要在260～280 nm之間，說明SSPP、SSPP-E內可能含有少量蛋白質或核酸等成分，和蛋白測定結果相一致。

圖1 SSPP和SSPP-E的紫外-可見光譜結果圖

2.6 紅外光譜分析

圖2 SSPP和SSPP-E紅外光譜結果圖

2.7 SSPP和SSPP-E的單糖組成分析

為了進一步研究酶解前后的單糖組成變化，采用PMP衍生化HPLC法進行單糖組成測定。

根據圖3～圖5可知，SSPP單糖組成的摩爾比∶甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖為0.05∶0.14∶0.13∶0.26∶0.18∶0.24；SSPP-E單糖組成的摩爾比∶甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖∶半乳糖∶木糖∶阿拉伯糖為0.08∶0.18∶0.12∶0.18∶0.21∶0.23。從單糖組成來看，組成SSPP和SSPP-E的單糖組成一致，但是單糖的摩爾比發(fā)生了變化，甘露糖、葡萄糖、木糖的含量增加，葡萄糖、半乳糖含量減小，阿拉伯糖量基本不變。這可能是因為在酶解修飾過程中，一些支鏈從糖鏈上斷裂，導致單糖比例發(fā)生變化。

注：1 甘露糖；2 鼠李糖；3 半乳糖醛酸；4 葡萄糖醛酸；5 葡萄糖；6 半乳糖；7 木糖；8 阿拉伯糖；9 果糖。圖3 標準品的PMP衍生物HPLC圖譜

注：1 露糖；2 葡萄糖醛酸；3 葡萄糖；4 半乳糖；5 木糖；6 阿拉伯糖。圖4 SSPP的PMP衍生物HPLC圖譜

注：1 甘露糖；2 葡萄糖醛酸；3 葡萄糖；4 半乳糖；5 木糖；6 阿拉伯糖。圖5 SSPP-E的PMP衍生物HPLC圖譜

2.8 淡豆豉多糖及酶解產物的抗氧化活性測定

2.8.1 清除DPPH自由基活性

由圖6可知，在一定的質量濃度范圍內，樣品質量濃度和清除率成一定的量效關系。在濃度為4 mg/mL時SSPP清除率為41.95%，SSPP-E的清除率為55.20%。通過計算IC50值得出，SSPP的IC50值為4.842 mg/mL，SSPP-E的IC50值為3.574 mg/mL，通過方差分析表明P<0.001，具有極顯著差異，說明酶解有利于提高淡豆豉多糖清除DPPH自由基的活性。

圖6 SSPP和SSPP-E清除DPPH自由基活性結果圖

2.8.2 清除羥基自由基的活性

由圖7可知，在一定的質量濃度范圍內，樣品質量濃度和清除率成正比關系，各樣品均呈現(xiàn)良好的線性關系。濃度為1.8 mg/mL時，SSPP的清除率為82.52%，SSPP-E為84.22%。田崇梅等[18]在黃芪多糖體外抗氧化性研究中得出當蒙古黃芪多糖的質量濃度為2 mg/mL時其清除率為85%，其研究與本實驗結果相差不大。通過計算IC50值得出，SSPP的IC50值為1.099 mg/mL，SSPP-E的IC50值為1.041 mg/mL，通過方差分析無顯著性差異(P>0.05)，說明在清除羥基自由基的活性時，淡豆豉多糖酶解產物與未酶解組差異不大。

圖7 SSPP和SSPP-E清除羥基自由基活性結果圖

2.8.3 ORAC的測定

對ORAC測定運用統(tǒng)計分析，采用Origin 8.0軟件作圖分析。

圖8 不同濃度的Trolox熒光衰退動力學曲線圖

通過計算不同摩爾濃度的Trolox與凈AUC值之間的線性關系得到方程：y=0.312 4x-1.625 9(R2=0.995 2)，由結果可知標準曲線的相關性較高。

表1 SSPP和SSPP-E的ORAC值

由表1可以看出，酶解后有利于ORAC值的升高，在樣品質量濃度為0.005 mg/mL時，SSPP和SSPP-E的ORAC值分別為1 492.16和2 123.90 μmol TE/g，方差分析表明P<0.001，具有極顯著差異，從結果可以看出，酶解有利于淡豆豉多糖氧自由基吸收能力的提高。

通過抗氧化活性測定結果表明：SSPP經過酶解后，其抗氧化活性得到增強。

3 結論

通過提取淡豆豉多糖，并對其進行酶解，通過比較酶解前后的理化性質及體外抗氧化活性得出：1)SSPP和SSPP-E均具有多糖的典型特征吸收峰，經過酶解后，SSPP-E的可溶性總糖含量、蛋白含量、單糖組成的摩爾比發(fā)生了變化。2)經過酶解后，體外抗氧化活性得到一定程度的提高。

淡豆豉多糖經過酶解后其體外活性有所提高，可能是因為部分蛋白被除去，暴露了更多的活性基團(如葡萄糖醛酸或其他結合的小分子化合物)，或者是酶解使得淡豆豉降解為分子質量較低的多糖，分子質量減小之后有利于多糖空間結構的舒展和與自由基的結合，提高抗氧化的能力，但具體的性質與活性之間的關系如何，有待進一步研究。