Klotho對缺血再灌注急性腎損傷的影響研究

章煒 王鳴 費曉 葛玉英 楊秀 謝祥成 楊麗莉 錢盈盈

急性腎損傷是臨床常見的危重病之一，具有發(fā)病率高，病情兇險，預(yù)后差等特點。迄今為止，除了腎臟替代治療外，其尚缺乏其他有效的治療方法?；騅lotho是Kuro等[1]在1997年研究原發(fā)性高血壓時發(fā)現(xiàn)的抗衰老基因，主要表達于腎臟組織。Klotho蛋白分為膜型和分泌型兩種。膜型Klotho蛋白是骨源性激素成纖維生長因子23的共受體，參與鈣磷代謝過程；分泌型Klotho蛋白為一種體液因子，可發(fā)揮多種生物學作用[2]。多種因素如炎癥因子、氧化應(yīng)激、尿毒癥毒素等可誘導Klotho表達下調(diào)[2]。研究顯示，急性腎損傷是一種Klotho缺乏性疾病，腎臟缺血期Klotho表達即開始下調(diào)，隨后出現(xiàn)血清Klotho蛋白水平下降，一直持續(xù)至再灌注后7 d仍未能完全恢復(fù)，補充Klotho蛋白可能具有保護作用[3]。然而，Klotho的具體作用機制仍未完全明確。基于此，本研究進一步探討Klotho對缺血再灌注急性腎損傷的影響及可能的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 60只SPF（無特定病原體）級雄性BALB/c小鼠，約 6～8周齡，體重20～25 g，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房。小鼠Klotho蛋白ELISA試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司）；小鼠中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白 （neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）ELISA試劑盒（美國R&D systems公司，MLCN20）；兔抗小鼠Klotho抗體（美國abcam公司，ab203576）；兔抗小鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）抗體（美國 abcam 公司，ab182858），兔抗小鼠B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（bcl-2-associated X protein，Bax）抗體（美國 abcam 公司，ab182733）；兔抗小鼠裂解的天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cleaved Caspase）-3抗體（美國Cell Signaling Technology公司，9661）；兔抗小鼠CD68抗體（美國abcam公司，ab125212）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司，DRR 037A）；real-time PCR熒光定量試劑盒（日本TAKARA公司，DRR081A）；Klotho蛋白（美國 R&D systems公司，1819-KL）；羊血清（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。PCR所需引物序列均采購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及建模 60只小鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)+0.9%氯化鈉注射液組（Sham+veh組）、假手術(shù)+Klotho補充組（Sham+kl組）、缺血再灌注急性腎損傷+0.9%氯化鈉注射液組（I/R+veh組）、缺血再灌注急性腎損傷+Klotho補充組（I/R+kl組），每組各15只。各組小鼠再按不同的處死時相（術(shù)后第1、2、7天）隨機分為D1（5只）、D2（5只）、D7（5只）3個亞組。采用雙側(cè)腎蒂夾閉法建立缺血再灌注急性腎損傷模型：小鼠以1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后剃毛、腹部皮膚消毒，沿腹正中線逐層剖開腹腔，以微血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂，可以看到腎臟顏色由鮮紅變?yōu)榘导t，保溫箱保溫。小鼠腎臟缺血處理35 min后移開動脈夾，確認腎臟恢復(fù)灌注后，逐層縫合腹腔。Sham+veh組和Sham+kl組小鼠定位腎蒂但不夾閉，其余操作同上。Sham+kl組和I/R+kl組予再灌注后30 min腹腔注射360 ng Klotho蛋白注射液，Sham+veh組和I/R+veh組腹腔注射0.2ml 0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2 腎臟組織病理學檢查 小鼠采用1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg）過量麻醉處死后，摘除雙側(cè)腎臟，去包膜，中性甲醛固定，石蠟包埋。石蠟切片行HE染色，光學顯微鏡下觀察腎小管損傷情況。高倍鏡下隨機觀察10個視野，腎小管損傷評分標準為：0分，＜10%的腎小管累及；1分，10%～25%的腎小管累及；2分，26%～50%的腎小管累及；3分，51%～75%的腎小管累及；4分，＞75%的腎小管累及。腎小管損傷表現(xiàn)包括小管擴張、管型形成、刷狀緣脫落、細胞壞死等表現(xiàn)。

1.2.3 尿NGAL、血Klotho蛋白、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）水平檢測采用代謝籠法收集小鼠24 h尿標本，采用眼球摘除法采集小鼠血液標本。尿NGAL、血Klotho蛋白水平采用ELISA檢測。BUN、Scr水平采用酶法檢測。

1.2.4 腎臟組織Klotho、Bcl-2、Bax mRNA表達水平檢測 采用real-time PCR法。具體方法及相關(guān)引物序列設(shè)計參考文獻[4]。各小鼠100 mg腎臟組織標本研磨后加入1 ml Trizol，提取總RNA。取1 μg RNA根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR GreenⅠ熒光法檢測目的基因及管家基因（gapdh）的表達水平。采用10 μl擴增體系，每個樣本重復(fù)3孔，以LightCycler 480型（德國羅氏公司）熒光檢測PCR儀進行擴增。以gapdh作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達水平。

1.2.5 腎臟組織 Klotho、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。各小組100 mg腎臟組織研磨后加入RIPA裂解液充分裂解，提取總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性后取30 μg樣本經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，分別孵育抗Klotho抗體（1：250）、抗 Bcl-2 抗體（1：500）、抗 Bax抗體（1：500）、抗 GAPDH抗體（1：1 000）、抗 Tubulin 抗體（1：1 000）、抗 Cleaved Caspase-3抗體（1：500）4℃過夜，經(jīng)洗滌后以相應(yīng)的熒光二抗常溫孵育1 h，最后應(yīng)用紅外激光成像系統(tǒng)（美國Odyssey公司，LI-COR）采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，采用Image-J圖像分析系統(tǒng)半定量分析目的蛋白的相對表達水平。

1.2.6 腎臟組織Klotho、CD68蛋白表達情況觀察 采用免疫組化法。腎組織標本經(jīng)固定后制成石蠟標本，切成4 μm厚度的切片，石蠟切片后經(jīng)脫蠟、水化、檸檬酸鹽熱修復(fù)抗原、0.3%雙氧水溶液封閉后，以10%羊血清常溫封閉 2 h，分別孵育抗 Klotho抗體（1：100）、抗CD68抗體（1：100）4℃過夜，洗滌后再以辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1h，經(jīng)沖洗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染等步驟，最后于光學顯微鏡（德國Leica公司，DMLB雙目顯微鏡）下觀察Klotho、CD68蛋白的表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Sham+veh組與 I/R+veh組血 BUN、Scr、尿 NGAL水平及腎小腎損傷情況比較 I/R+veh組小鼠術(shù)后第1天BUN、Scr水平較Sham+veh組明顯升高[（45.57±8.67）mmol/L 比 （8.18±2.17）mmol/L，（130.00±30.07）μmol/L 比（14.00±6.60）μmol/L，均 P＜0.05），分別升至 Sham 組的5倍及9倍以上，腎損傷標志物尿NGAL水平升高100倍以上[（7 766.46±1 249.78）ng/ml比（61.16±11.39）ng/ml，P＜0.05]，至術(shù)后第 7 天基本恢復(fù)正常，兩組以上指標比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見圖1。腎臟組織HE染色顯示，I/R+veh組小鼠術(shù)后第1天腎小管上皮細胞刷狀緣消失，部分腎小管管腔擴張，小管細胞變性、壞死脫落，部分基底膜裸露，間質(zhì)可見炎癥細胞浸潤，至術(shù)后第7天，腎小管損傷明顯減輕，見圖2（插頁）。

2.2 Sham+veh組與I/R+veh組血Klotho水平及腎臟組織Klotho mRNA、蛋白表達水平比較 I/R+veh組小鼠術(shù)后第1天血Klotho水平較Sham+veh組下降[（669.89±136.51）pg/ml比（2 093.44±476.74）pg/ml，P＜0.05]，至術(shù)后第7天仍未能恢復(fù)正常[（703.71±116.67）pg/ml比（1 902.73±496.39）pg/ml，P＜0.05]。I/R+veh 組小鼠術(shù)后第1天腎臟組織Klotho mRNA、蛋白表達水平均較Sham+veh組下降（均P＜0.05），見圖3。免疫組化顯示，腎臟Klotho蛋白主要表達于腎小管上皮細胞，在缺血再灌注急性腎損傷時表達下調(diào)，見圖4（插頁）。

圖1 Sham+veh組與I/R+veh組血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、尿中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）水平比較（a：BUN水平比較；b：Scr水平比較；c：尿 NGAL 水平比較；與 Sham+veh 組比較，*P＜0.05）

圖2 Sham+veh組與I/R+veh組腎損傷情況比較[a：腎臟組織光鏡下所見（HE染色，×200）；b：腎小管損傷評分比較；*P＜0.05]

圖3 Sham+veh組與I/R+veh組血Klotho蛋白水平及腎臟組織Klotho mRNA、蛋白表達水平比較（a：血Klotho蛋白水平比較；b：腎臟組織Klotho mRNA表達水平比較；c：腎臟組織術(shù)后第1天的Klotho蛋白表達電泳圖；與Sham+veh組比較，*P＜0.05）

圖4 Sham+veh組與I/R+veh組腎臟組織術(shù)后第1天的Klotho蛋白的表達光鏡下所見（a：Sham+veh組；b：I/R+veh組術(shù)后第1天；免疫組化染色，×200）

2.3 Sham+veh組、Sham+kl組、I/R+veh 組、I/R+kl組腎臟組織Bax/Bcl-2 mRNA、蛋白及cleaved Caspase-3蛋白表達水平比較 與Sham+veh組比較，I/R+veh組小鼠術(shù)后第1、2天腎臟組織Bax/Bcl-2 mRNA表達水平分別升高約4.3倍、1.2倍（均P＜0.05），至術(shù)后第7天基本恢復(fù)正常。與I/R+veh組比較，I/R+kl組小鼠腎臟組織Bax/Bcl-2 mRNA表達水平于術(shù)后第1、2天分別下降約30%、20%（均P＜0.05）。同樣地，I/R+veh組小鼠術(shù)后第1天腎臟組織Bax/Bcl-2蛋白表達水平與Sham+veh組相比升高3倍以上（P＜0.05），I/R+Klotho組小鼠術(shù)后第1天腎臟組織Bax/Bcl-2蛋白表達水平與I/R+veh組比較下降45%（P＜0.05）。此外，與Sham+veh組比較，I/R+veh組小鼠術(shù)后第1天腎臟組織cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高約7.3倍（P＜0.05），I/R+Klotho組小鼠術(shù)后第1天cleaved Caspase-3蛋白表達水平較I/R+veh組下降約62%（P＜0.05），見圖5。

2.4 Sham+veh組、I/R+veh組、I/R+kl組腎臟組織CD68+細胞浸潤情況比較 與Sham+veh組比較，I/R+veh組術(shù)后第1天腎間質(zhì)（包括皮質(zhì)和髓質(zhì)）CD68+細胞浸潤數(shù)量明顯增多；I/R+kl組術(shù)后第1天腎間質(zhì)（包括皮質(zhì)和髓質(zhì)）CD68+細胞浸潤數(shù)量較I/R+veh組明顯減少，見圖 6（插頁）。

圖5 Sham+veh組、Sham+kl組、I/R+veh組、I/R+kl組腎臟組織B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白（Bax）/B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）mRNA、蛋白及裂解的天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶（cleaved Caspase-3）表達水平比較（a：Bax/Bcl-2 mRNA表達水平比較；b：Bax/Bcl-2蛋白表達電泳圖及表達水平比較；c：cleaved Caspase-3表達電泳圖及表達水平比較）

圖6 Sham+veh組、I/R+veh組、I/R+kl組腎臟組織CD68+細胞浸潤情況光鏡下所見（a：Sham+veh組；b：I/R+veh組術(shù)后第1天；c:I/R+kl組術(shù)后第1天；免疫組化染色，×400）

3 討論

隨著醫(yī)學技術(shù)的不斷進步，急性腎損傷的病死率呈下降趨勢，然而即使患者耐受了急性應(yīng)激存活下來，其長期預(yù)后仍不容樂觀[5]。近一半需要腎臟替代治療的急性腎損傷患者出院后存在輕到中度的腎臟損害，3年終末期腎病發(fā)生率高達10%[6]。目前，腎臟替代治療仍是急性腎損傷的主要治療方法，然而接受腎臟替代治療的患者其病死率仍然較高（49.7%）[5]。目前，越來越多的研究將注意力轉(zhuǎn)向?qū)ふ倚碌募毙阅I損傷治療靶點。本研究探討Klotho在急性腎損傷中的作用機制，發(fā)現(xiàn)急性腎損傷時腎臟組織Klotho表達下降，補充Klotho蛋白具有抗凋亡和抗炎作用，可能是潛在的治療靶點。

缺血再灌注急性腎損傷是臨床上最常見的急性腎損傷病因之一。由于生理情況下近端小管氧分壓較低而需氧量大的特殊生理結(jié)構(gòu)，導致腎臟遭受缺血再灌注時，近端小管上皮細胞受損最為嚴重。急性腎損傷的病理生理過程復(fù)雜，研究表明血管損傷、骨架破壞、細胞凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥均參與了急性腎損傷的發(fā)病過程。腎臟缺血時，ATP大量消耗，激活一系列Caspase家族蛋白酶，導致細胞凋亡。越來越多的證據(jù)提示細胞凋亡是急性腎損傷時腎小管上皮細胞早期死亡的主要方式，抑制凋亡過程可以保護腎臟[7-8]。主要有兩種途徑參與了細胞凋亡，包括死亡受體途徑和線粒體途徑。Bcl-2家族蛋白是線粒體途徑凋亡的主要調(diào)節(jié)因子。其中，促凋亡因子（如Bax）和抗凋亡因子（如Bcl-2）之間的平衡決定著細胞的命運。研究顯示，線粒體途徑誘導的細胞凋亡在急性腎損傷的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，近端小管局部Bax基因敲除小鼠可以明顯緩解腎臟缺血再灌注誘導的腎小管細胞凋亡，改善腎功能，減輕腎臟組織學損害[9]。

Klotho蛋白是由抗衰老Klotho基因編碼的一種單向跨膜蛋白，主要表達于腎小管上皮細胞，并可分泌至血、尿、腦脊液中。作為抗衰老物質(zhì)，Klotho已引起廣泛重視，Klotho與疾病的相關(guān)性也成為熱門研究，如Klotho在某些疾?。ㄈ缒[瘤）中作為早期診斷標志物和治療手段的可能性，Klotho基因多態(tài)性與人類壽命、骨質(zhì)疏松、原發(fā)性高血壓、腦卒中和冠狀動脈性心臟病等疾病的相關(guān)性。Klotho在急性腎損傷時的具體作用機制尚不明確。有研究表明，Klotho可以通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶[10]、炎癥[11]等途徑發(fā)揮抗凋亡作用。Klotho在急性腎損傷時的腎臟保護作用可能和其抗凋亡作用密切相關(guān)。本研究結(jié)果進一步支持了這一點。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠急性腎損傷后給予可溶性Klotho蛋白治療，腎臟組織Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白表達水平、cleaved Caspase3蛋白表達水平同樣于再灌注后24 h較未治療急性腎損傷小鼠顯著降低。其他研究也表明，抑制細胞凋亡過程可以明顯改善腎臟損傷[12]。因此，外源性補充可溶性Klotho蛋白可以明顯改善急性腎損傷時腎臟組織細胞凋亡狀態(tài)，提示Klotho在急性腎損傷時的腎臟保護作用可能和其抑制細胞凋亡作用有關(guān)。

另一方面，單核/巨噬細胞的浸潤與缺血再灌注所致急性腎損傷的發(fā)病相關(guān)。選擇性清除單核/巨噬細胞可改善急性腎損傷[13]。因此，單核/巨噬細胞的浸潤促進了腎損傷的發(fā)生、發(fā)展，抑制該過程可能可以防治急性腎損傷。本研究結(jié)果也證實急性腎損傷小鼠腎間質(zhì)中CD68+細胞增多，提示存在巨噬細胞浸潤。外源性補充Klotho蛋白可以減少急性腎損傷時CD68+細胞的浸潤。其他研究也指出Klotho具有抗炎作用，包括可以抑制腫瘤壞死因子-α誘導的NF-κB活化和內(nèi)皮黏附分子的表達[14]，可改善主動脈瓣膜炎癥[15]。因此，Klotho在急性腎損傷時的腎臟保護作用還可能與其抗炎作用有關(guān)。

綜上所述，缺血再灌注急性腎損傷時Klotho表達下調(diào)；急性腎損傷后，外源性補充Klotho蛋白可以發(fā)揮腎臟保護作用。Klotho蛋白可能是通過抑制細胞凋亡及炎癥細胞的浸潤等途徑緩解急性腎損傷。