E-Cadherin/β-Catenin 與PTEN-PI3K/Akt在卵巢漿液性腫瘤中的表達及其意義

陳勝民 王國平 林志仁 袁峰

卵巢漿液性腫瘤（ovarian serous tumor，OST）是一類異質(zhì)性腫瘤，不同級別卵巢腫瘤生物學行為有顯著差異，預后明顯不同，同時由于缺乏早期診斷手段，復發(fā)率和病死率高[1]。卵巢漿液性交界性腫瘤（ovarian serous borderline tumor，OSBT）又稱卵巢低度惡性潛能（low malignant potential，LMP）上皮性腫瘤，約占卵巢上皮性腫瘤的15%～20%，OSBT的生物學行為介于良性與惡性腫瘤之間。相較于卵巢漿液性癌（ovarian serous carcinoma，OSC），OSBT 多發(fā)生于育齡女性，多見于 25～55歲，一般期別較早，病程進展慢，預后好，約占卵巢交界性腫瘤的65%，其他病理類型較少見[2]。研究證實，當β-連環(huán)蛋白（Beta-catenin，β-Catenin）的酪氨酸磷酸化時，上皮型-鈣粘蛋白（epithelial calcium-dependent cell adhesion proteins，E-Cadherin）/β-Catenin 復合體解聚，ECadherin表達下調(diào)，導致細胞間粘附力降低，促使腫瘤原發(fā)灶侵襲轉(zhuǎn)移[3]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因（phosphatase and tension homologdeleted on chromosome ten，PTEN）缺失和或磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激活可使其下游分子，絲氨酸蛋白激酶B473（protein kinase B，PKB/AktSer473）磷酸化導致Akt活化，激活或抑制其下游靶蛋白，導致癌變進展，而PTEN的過表達則可抑制細胞增殖遷移[4]。目前雖然有文獻報道了上述部分蛋白在OSC中的表達情況，但未見上述全部蛋白表達在OST中的表達差異以及相互之間關(guān)系的報道。為此本研究應用免疫組化法，檢測 OST 中 E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin以及Ki-67蛋白的表達并分析其相互關(guān)系，探討OST的發(fā)生發(fā)展機制，為OST的臨床診治以及預后判斷提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集本院病理科2002年1月至2017年11月石蠟包埋組織標本共100例，其中正常卵巢組織（normal ovarian tissue，NOT）10 例、卵巢漿液性囊腺瘤（ovarian serous cystadenoma，OSA）12 例、OSBT18例、OSC60例，各種標本組織切片均已由病理學專家進行診斷和分類。

1.1.2 主要試劑 鼠抗人E-Cadherin、β-Catenin、PTEN以及Ki-67單抗（抗體批號：TA800670、ZM-0442、ZM-0116、TA500265）和S-P試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人PI3Kp110α和p-AktSer473單抗（抗體批號：4249T、4060T）購于美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化檢測 采用免疫組化SP三步法檢測ECadherin、β-Catenin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473以及Ki-67表達，用已知陽性組織作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照，具體實驗步驟均按試劑說明書進行操作。

1.2.2 結(jié)果判斷 E-Cadherin陽性表達部位是細胞膜和（或）細胞質(zhì)，β-Catenin陽性表達部位是細胞膜或細胞核，PTEN、PI3Kp110α和p-AktSer473陽性表達與細胞質(zhì)和（或）細胞核，Ki-67陽性表達部位是細胞核。鏡下隨機觀察10個視野，避開切片周邊，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞，共計1 000個細胞，陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比為陽性細胞比例，取其平均值。對腫瘤細胞的 E-Cadherin、β-Catenin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473表達進行評價時，陽性細胞占比計分如下：陽性細胞占比＜5%計 0分，6%～25%計 1分，26%～50%計 2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；另外根據(jù)細胞染色強度計分，細胞定位部位無顯色計0分，淺棕黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。根據(jù)陽性細胞占比和著色強度來綜合判斷，最終結(jié)果由兩項記分相乘所得，0～1 分為-，2～4 分為+，5～8 分為++，9～12 分為3+++。其中-為陰性，+～+++為陽性[5]。Ki-67 的表達采用陽性細胞率。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組 E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin以及Ki-67表達比較 各組間總體比較，OSC組E-Cadherin、PTEN陰性細胞率均高于OSBT、OSA和NOT組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin以及Ki-67陽性細胞率高于OSBT、OSA和NOT組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。見表 1，圖 1-4（插頁）。

圖1 PI3Kp110α在OSC中的表達（SP染色，×200）

圖2 p-AktSer473在OSC中的表達（SP染色，×200）

圖3 β-Catenin在OSC中的表達（SP染色，×200）

圖4 Ki-67在OSC中的表達（SP染色，×200）

2.2 不同臨床特征OSC中E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、β-Catenin以及Ki-67表達比較 浸潤與非浸潤的OSC標本比較，E-Cadherin陰性細胞率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），PTEN陰性細胞率的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSC標本比較，E-Cadherin、PTEN陰性細胞率的差異也有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；有無浸潤與浸潤、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSC間分別比較，PI3Kp110α、p-AktSer473、β-Catenin 以及Ki-67陽性細胞率的差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

3 討論

3.1 E-Cadherin/β-Catenin在OST發(fā)生發(fā)展中的作用 正常情況下，E-Cadherin和β-Catenin構(gòu)成復合體，錨定于肌動蛋白細胞骨架上，使相鄰細胞形成穩(wěn)定連接[3，6]。在異常因素觸發(fā)下，β-Catenin的酪氨酸發(fā)生磷酸化，E-Cadherin/β-Catenin 復合體解聚，E-Cadherin 表達下調(diào)，導致細胞間的粘附力降低，細胞發(fā)生分散，從而出現(xiàn)向外周侵襲性生長的現(xiàn)象，最終腫瘤脫離原發(fā)灶發(fā)生轉(zhuǎn)移[3，7]。本研究顯示，E-Cadherin蛋白表達缺失在不同類型的OST之間存在差異，E-Cadherin蛋白表達缺失率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，表明E-Cadherin表達缺失可能與OST發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究還顯示，β-Catenin陽性表達率在不同類型的OST之間也存在差異，β-Catenin蛋白陽性表達率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，表明β-Catenin蛋白過表達也可能與OST發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究表明OST的發(fā)生發(fā)展，伴隨著惡性程度增高的過程，與OST中E-Cadherin功能缺失，伴隨β-Catenin過表達逐級增高，可能具有同步一致性。

3.2 PTEN-PI3K/Akt信號通路參與OST的發(fā)生發(fā)展 研究發(fā)現(xiàn)，PTEN通過其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于PI3K的下游靶分子3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3），阻斷 PI3K/AKT信號傳導，從而實現(xiàn)其抑癌作用，將此稱為PTENPI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導通路[8-10]。目前認為，與卵巢癌密切相關(guān)的是ⅠA型PI3K，其是由p85調(diào)節(jié)亞基和p110催化亞基組成的異二聚體。PKB/Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是PI3K信號傳導通路中的下游靶激酶。正常情況下，PTEN負調(diào)節(jié)PI3K，但在細胞外因子異常刺激下Ras和p110α直接結(jié)合導致PI3K活化。PTEN缺失或PI3K激活均可使其下游分子Akt的Ser473發(fā)生磷酸化導致Akt活化，從而激活或抑制其下游靶蛋白，使OST發(fā)生進展，而PTEN的過表達則可抑制細胞增殖遷移[11-14]。本研究顯示，PTEN蛋白表達缺失率在不同類型的OST之間存在差異，PTEN蛋白表達缺失率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，表明PTEN蛋白表達缺失參與OST的發(fā)生進展。本研究還顯示，PI3Kp110α、p-AktSer473以及Ki-67蛋白陽性表達率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT，提示PI3K/Akt過表達與OST的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此推測PTEN功能的缺失與PI3Kp110α、p-AktSer473蛋白的激活在OST的發(fā)生發(fā)展可能存在協(xié)同作用。本研究表明，在OST的發(fā)生發(fā)展中存在PTEN功能缺失，伴隨PI3Kp110α、p-AktSer473以及Ki-67過表達，提示 PTEN和PI3K/Akt共同參與OST的發(fā)生、發(fā)展。

表1 各組 E-Cadherin、PTEN、PI3Kp110α、β-Catenin以及 Ki-67表達比較[例（%）]

表2 不同臨床特征OSC中各種蛋白表達比較[例（%）]

3.3 E-Cadherin/β-Catenin 與 PTEN-PI3K/Akt共同參與OST的發(fā)生發(fā)展 有研究顯示在OSC中，E-cadherin可減少β-Catenin在細胞核中的積累，誘導PTEN表達，抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導，從而抑制細胞生長[14-15]。在OST癌變過程中，E-cadherin缺失，細胞核中β-Catenin發(fā)生積累，導致β-Catenin反式激活，從而抑制PTEN水平，激活PI3K/AKT信號通路，通過抑制糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase-3，GSK3β）進一步穩(wěn)定β-Catenin信號，促進OST的發(fā)生發(fā)展[14-17]，見圖5。本研究顯示，E-Cadherin、PTEN蛋白表達缺失在不同類型的OST之間存在差異，在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是 NO。PI3Kp110α、p-AktSer473以及β-Catenin蛋白陽性表達率在OSC中最高，其次是OSBT、OSA，最低的是NOT。本研究發(fā)現(xiàn)，在OST的發(fā)生發(fā)展中，E-Cadherin、PTEN蛋白表達缺失，而PI3Kp110α、p-AktSer473以及β-Catenin過表達，同時發(fā)現(xiàn)Akt活化時Ki-67蛋白表達，即增殖活性呈顯著相關(guān)，提示Akt活化后可能通過Wnt信號通路阻斷GSK3β活性，導致過度增殖癌變進展。

圖5 E-Cadherin/β-Catenin通過PTEN-PI3K/Akt調(diào)控 OST癌變進展

目前為止，關(guān)于OST病因及發(fā)生機制尚不清楚，為降低OST的發(fā)病率，提高生存期以及生活質(zhì)量，其發(fā)病機制的研究是目前的重中之重。不同階段卵巢腫瘤生物學行為有顯著差異，預后明顯不同，由于缺乏早期診斷手段，復發(fā)率和病死率高，預后差。本研究發(fā)現(xiàn)E-Cadherin/β-Catenin與PTEN-PI3K/Akt信號通路共同參與OST的發(fā)生發(fā)展，本研究從蛋白質(zhì)表達角度比較了不同類型的OST之間各蛋白表達差異，探討各自的功能和相互關(guān)系，不僅有助于揭示OST的病因以及發(fā)病機制，而且為不同階段OST的早期診斷，開發(fā)新的抗癌藥物和尋求新的基因治療以及預后判斷提供了新的思路。