脂聯(lián)素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制探索

李鑫 張倩云 徐潔 楊邵瑜 潘月龍

脂聯(lián)素（adiponectin,ADPN）是一種脂肪組織分泌的脂肪因子，具有調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)、調(diào)控胰島素敏感性和抗炎等多種有益的生物學(xué)功能[1]。ADPN主要通過(guò)ADPN受體1和ADPN受體2兩種受體發(fā)揮作用，這兩種受體廣泛表達(dá)于各種組織器官中[2]。在患有代謝性疾病如肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征的患者中，ADPN水平顯著降低[3]。此外，低ADPN血癥是代謝綜合征的相關(guān)癌癥危險(xiǎn)因素，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌等[4-6]。

結(jié)直腸癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[7]，研究提示肥胖與結(jié)直腸癌相關(guān)[8]，營(yíng)養(yǎng)相關(guān)因素可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[9]。糖尿病和高胰島素、C肽血癥與結(jié)直腸癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[10]。有研究指出ADPN在直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤新生血管形成以及改善外周胰島素抵抗方面具有積極的抗腫瘤作用[11]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)ADPN水平與癌癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，而體外研究表明ADPN在調(diào)控細(xì)胞增殖方面起重要作用，雖然具體機(jī)制目前尚不明確[4，12]。因此本研究在上述研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討重組ADPN在高糖高胰島素環(huán)境下對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株MCA38增殖和遷移的影響及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株MCA38由浙江大學(xué)腫瘤研究所惠贈(zèng)。

1.2 主要試劑及儀器 小鼠重組ADPN購(gòu)自北京康肽生物科技有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；RPMI1640培養(yǎng)基、FBS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；SpectraMaxM3型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；ChemiDoc XRS+型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株MCA38置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)覆蓋培養(yǎng)瓶底部面積80%時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化，待鏡下觀察收縮至圓形且脫落時(shí)，加入培養(yǎng)液終止消化，1 000 r/min離心5 min后，按適當(dāng)比例（1:3）進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞分組 根據(jù)處理藥物濃度的不同，將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為6組：空白組、對(duì)照組（25 mmol/L葡萄糖+125 μIU/ml胰島素）、A組（25 mmol/L葡萄糖+125 μIU/ml胰島素+2.5 μg/ml ADPN）、B 組（25 mmol/L 葡萄糖+125 μIU/ml胰島素+5μg/mlADPN）、C組（25mmol/L葡萄糖+125μIU/ml胰島素+10 μg/ml ADPN）、D 組（25 mmol/L葡萄糖+125 μIU/ml胰島素+20 μg/ml ADPN）。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 采用MTT實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCA38細(xì)胞接種于96孔板，每孔4×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h貼壁后，分別按上述分組給予不同濃度藥物處理，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，作用72 h后，每孔加入 10 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去上清液，加入 100 μl二甲基亞砜，震蕩使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)495 nm處的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%（空白組除外）。

1.3.4 細(xì)胞遷移數(shù)檢測(cè) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將Transwell小室置于24孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCA38細(xì)胞制備成10×104/L無(wú)血清培養(yǎng)液的細(xì)胞懸液，上室中加細(xì)胞懸液200 μl，分別按上述分組給予不同濃度藥物處理，下室中加入600 μl 20%FBS細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃孵育24 h，甲醇固定后，結(jié)晶紫避光染色30 min，流水清洗，取4個(gè)視野，攝像并計(jì)數(shù)平均細(xì)胞遷移數(shù)。

1.3.5 細(xì)胞增殖與遷移相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取上述各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，提取蛋白，蛋白定量后上樣，80 V電泳0.5 h后轉(zhuǎn)120 V凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%牛奶4℃封閉1 h，加入一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，清洗后加入二抗，4℃搖床孵育2 h，條帶加顯影液后曝光，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖片，ImageJ軟件分析灰度值，計(jì)算胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體（IGF-2R）、大鼠肉瘤病毒癌基因蛋白（Ras）、過(guò)氧化物酶增殖激活受體 γ（PPARγ）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 1（PAK-1）表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5組細(xì)胞增殖抑制率比較 對(duì)照組、A、B、C、D組任意兩組細(xì)胞增殖抑制率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且ADPN濃度越高，細(xì)胞增殖抑制率越高，見(jiàn)表1。

表1 5組細(xì)胞增殖抑制率比較（%）

2.2 6組細(xì)胞遷移數(shù)比較 空白組、對(duì)照組、A、B、C、D組任意兩組細(xì)胞遷移數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且ADPN濃度越高，細(xì)胞遷移數(shù)越少。見(jiàn)圖1（插頁(yè)）、表2。

圖1 6 組細(xì)胞遷移數(shù)比較（a：空白組；b：對(duì)照組；c：A 組；d：B 組；e：C 組；f：D 組；結(jié)晶紫染色，×200）

表2 6組細(xì)胞遷移數(shù)比較（個(gè)）

2.3 6 組細(xì)胞 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，B、C、D 組 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與A 組比較，C、D 組 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1 表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與B組比較，C、D組IGF-2R、Ras表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與C組比較，D組IGF-2R、PAK-1表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1蛋白電泳圖（IGF-2R 為胰島素樣生長(zhǎng)因子2受體；Ras為大鼠肉瘤病毒癌基因蛋白；PPARγ為過(guò)氧化物酶增殖激活受體γ；PAK-1為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1；a：空白組；b：對(duì)照組；c：A 組；d：B 組；e：C 組；f：D 組）

3 討論

結(jié)直腸癌是全世界最常見(jiàn)的癌癥之一[7]，肥胖與結(jié)腸腺瘤、結(jié)腸癌的發(fā)病率呈正相關(guān)[13]，而結(jié)直腸癌合并糖尿病患者的病死率高于單純腸癌患者[14]。慢性高胰島素血癥可能會(huì)刺激胰島素受體（IR）信號(hào)途徑，從而誘導(dǎo)乳腺癌和胰腺癌的腫瘤生長(zhǎng)[15]，還有研究表明隨著胰島素水平增高會(huì)增加患結(jié)腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[16]。Lu等[17]發(fā)現(xiàn)胰島素可以通過(guò)IR信號(hào)、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶-3（PI3K/AKT/GSK3β）通路以及基質(zhì)金屬蛋白酶-2的調(diào)節(jié)來(lái)促進(jìn)結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移。

表3 6組細(xì)胞 IGF-2R、Ras、PPARγ、PAK-1表達(dá)水平比較

有薈萃分析提示大腸癌和腺瘤患者的ADPN水平明顯低于對(duì)照組[18]；同時(shí)有學(xué)者對(duì)17項(xiàng)相關(guān)研究作了薈萃分析，發(fā)現(xiàn)ADPN水平與結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著的負(fù)相關(guān)[7]。ADPN是一種重要的脂肪因子，最初發(fā)現(xiàn)其具有為胰島素增敏和調(diào)控代謝功能[19]，后來(lái)發(fā)現(xiàn)在炎癥和細(xì)胞增殖等多種細(xì)胞周期中其均有所作用[4-6]。目前研究發(fā)現(xiàn)ADPN可通過(guò)多種途徑發(fā)揮其抑癌作用，其中單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）的激活起著核心作用。ADPN激活A(yù)MPK并抑制PI3K/AKT、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（MTOR）、絲裂原活化激酶（MAPK）、Wnt-GSK3β以及 Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（JAK/STAT）通路，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)[20-21]。

雖然已經(jīng)有了一些相關(guān)的基礎(chǔ)研究，但ADPN對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的作用仍然存在爭(zhēng)議。Ogunwobi等[22]報(bào)道了全長(zhǎng)和球形ADPN對(duì)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的促進(jìn)作用，認(rèn)為ADPN對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有促增殖和促炎作用。2009年，Sugiyama等[23]揭示了ADPN受體在三種大腸癌細(xì)胞系HT29、LoVo和HCT116上的表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)ADPN可通過(guò)激活A(yù)MPK下調(diào)mTOR通路，從而抑制腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Kim等[24]研究顯示ADPN在細(xì)胞周期的G1/S期抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。Fenton等[25]報(bào)道ADPN處理MC-38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞不抑制胰島素誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，但可通過(guò)降低STAT-3的磷酸化和活化來(lái)抑制IL-6誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。Habeeb等[26]發(fā)現(xiàn)ADPN在含糖培養(yǎng)基中抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株的生長(zhǎng)，而在無(wú)糖培養(yǎng)基中ADPN支持細(xì)胞存活，并增加ADPN受體的表達(dá)。此外，他們還發(fā)現(xiàn)ADPN通過(guò)增強(qiáng)自噬機(jī)制來(lái)支持細(xì)胞在缺糖狀態(tài)下的存活。還有研究發(fā)現(xiàn)ADPN不參與腸癌細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化，而是促進(jìn)炎癥性IL-6和IL-8細(xì)胞因子mRNA的水平增加，研究者認(rèn)為ADPN可能會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)結(jié)直腸細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活和遷移。

筆者研究了重組ADPN在高糖高胰島素環(huán)境下對(duì)小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株MCA38的抑制作用，發(fā)現(xiàn)在高糖高胰島素條件下，ADPN可以顯著抑制MCA38細(xì)胞的增殖，且濃度越高抑制作用越顯著。筆者進(jìn)一步分析加入ADPN后對(duì)胰島素促增殖相關(guān)的IR信號(hào)、下游RASRaf-MAPK通路、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和遷移中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)。IGF-2R屬于I型跨膜糖蛋白，具有多種功能，其既參與IGF-2降解，又參與新合成的甘露糖-6-磷酸基化的溶酶體酶和活化生長(zhǎng)抑制物TGFB1等，從而促進(jìn)凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)揮抑癌作用[27]。在高糖高胰島素條件下，加入ADPN后IGF-2R蛋白表達(dá)受到抑制，表明ADPN可通過(guò)IGF-2R發(fā)揮抑癌作用，它的作用機(jī)制可能在下游胞內(nèi)信號(hào)通路傳遞，所以筆者進(jìn)一步分析了下游RAS-Raf-MAPK通路中關(guān)鍵的Ras蛋白表達(dá)。Ras蛋白為膜結(jié)合型的GTP/GDP結(jié)合蛋白，它們是H-ras、K-ras、N-ras的編輯產(chǎn)物，Ras蛋白的活性狀態(tài)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞骨架、蛋白質(zhì)運(yùn)輸和分泌等都具有影響。抑制Ras蛋白活性能抑制依賴Ras蛋白的腫瘤細(xì)胞增殖，也能干擾血管生成[28]。在高糖高胰島素條件下，加入ADPN后Ras蛋白表達(dá)受到抑制，可能通過(guò)影響RASRaf-MAPK通路抑制腫瘤生長(zhǎng)。

此外筆者發(fā)現(xiàn)在高糖高胰島素條件下，ADPN可以顯著抑制MCA38細(xì)胞的遷移，筆者分析了與細(xì)胞遷徙顯著相關(guān)的PAK-1和PPARγ蛋白。PAK-1激酶參與整合素和受體類(lèi)型激酶下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，在細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)、細(xì)胞黏附、遷移、增殖中發(fā)揮重要作用[29]。腫瘤發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）后細(xì)胞表現(xiàn)為極性的喪失、黏附性降低、遷移能力增強(qiáng)，PPARγ是EMT的重要調(diào)節(jié)因子。研究提示PPARγ激活后，能通過(guò)調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋白、Smad復(fù)合體和腫瘤微環(huán)境等影響腫瘤EMT的發(fā)生和發(fā)展[30]。本研究發(fā)現(xiàn)高糖高胰島素條件下，加入ADPN可以抑制PAK-1和PPARγ的表達(dá)。

綜上所述，筆者發(fā)現(xiàn)在高糖高胰島素環(huán)境中，ADPN作用于小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株MCA38，可能通過(guò)抑制RASRaf-MAPK信號(hào)通路和PAK-1和PPARγ遷移相關(guān)蛋白來(lái)抑制細(xì)胞增殖和遷移。雖然ADPN在癌癥中作為分子介質(zhì)的作用尚未完全確定，但本研究提示ADPN在胰島素通路和結(jié)腸腫瘤遷徙中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，但仍需要進(jìn)一步的研究來(lái)闡明ADPN與結(jié)直腸癌相關(guān)的潛在分子機(jī)制。