對(duì)苯醌在污水地下滲濾系統(tǒng)中的代謝路徑分析

李柏萱 林琳 鄭雅琴 朱劉陽(yáng) 高頡 李英華

（東北大學(xué)資源與土木工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110000）

1 引言

污水地下滲濾系統(tǒng)（Subsurface Wastewater Infiltration System，SWIS）是一種基于自然生態(tài)原理的分散式污水處理技術(shù)，具有不產(chǎn)生污泥、管理方便、處理效果好、工藝流程簡(jiǎn)單［1］、運(yùn)行費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，其理論研究和工程應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，學(xué)者們從多個(gè)角度對(duì)SWIS 污水處理能力進(jìn)行了探究。

李曉東等［2］在水力負(fù)荷為0.08 m3/（m2·d）時(shí)，對(duì)比了連續(xù)運(yùn)行和間歇運(yùn)行對(duì)污水地下滲濾系統(tǒng)污染物凈化能力的影響。研究表明，干濕交替運(yùn)行對(duì)污水地下滲濾系統(tǒng)的凈化能力有顯著的影響，其中干濕比為1∶1 時(shí)取得最好的凈化污染物的效果。嚴(yán)群等［1］研究了生物基質(zhì)對(duì)SWIS 脫氮效果及相關(guān)微生物的影響，結(jié)果表明，生物基質(zhì)可提高SWIS 的脫氮效果，并且可以提升SWIS 中相關(guān)微生物的豐度。楊蕾等［3］研究了SWIS 微生物代謝組學(xué)在不同有機(jī)負(fù)荷、不同剖面的變化，分析了差異性產(chǎn)物的代謝通路，利用RDA 分析探索了該代謝產(chǎn)物與主要環(huán)境因子（COD，NH4+，ORP 等）的相關(guān)性，研究表明，在中等負(fù)荷下（COD＝400 mg/L），微生物代謝產(chǎn)物與基質(zhì)層高度顯著相關(guān)。Li 等［4］對(duì)比了不同服務(wù)年限（7 年和1 年）的SWIS 在污染物去除效率方面的差異，結(jié)果顯示，長(zhǎng)期服務(wù)時(shí)，SWIS 對(duì)污水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（氮和磷）的去除能力有所削弱。遺憾的是，并未針對(duì)其微觀機(jī)理，尤其是微生物代謝過(guò)程的差異方面展開討論。

代謝組學(xué)作為研究細(xì)胞和生物體的所有代謝中間體和終產(chǎn)物的一門新興學(xué)科，運(yùn)用核磁共振（NMR）技術(shù)、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）技術(shù)和液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)定性、定量地分析細(xì)胞內(nèi)外存在的全部低分子量產(chǎn)物［5］，這使得微生物的代謝產(chǎn)物檢測(cè)以及根據(jù)代謝產(chǎn)物的動(dòng)力過(guò)程反向推導(dǎo)代謝途徑成為可能。在SWIS 的研究中，結(jié)合代謝組學(xué)可以更深入地了解在不同的外界條件下微生物的代謝過(guò)程、平衡機(jī)制以及調(diào)控機(jī)制，有助于更系統(tǒng)、深入地研究SWIS 的污染去除機(jī)理。本研究將代謝組學(xué)與SWIS 相結(jié)合，經(jīng)預(yù)處理、統(tǒng)計(jì)分析、生物學(xué)解釋獲得大量的數(shù)據(jù)，探究代謝產(chǎn)物蘊(yùn)含的生物學(xué)信息，研究了對(duì)苯醌的代謝通路，以期為揭示SWIS運(yùn)行的“黑箱”機(jī)制提供數(shù)據(jù)支持。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

利用如圖1 所示的模擬裝置進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中1＃裝置為空白對(duì)照組，進(jìn)水為清水；2＃裝置進(jìn)水為COD濃度為500 mg/L 的模擬生活污水。模擬裝置的主體為180 cm×φ30 cm（高×直徑）的圓柱，從上至下，所填充基質(zhì)分別為15 cm 厚的礫石、10 cm 厚的細(xì)沙以及140 cm 厚的混合基質(zhì)（沙、爐渣和農(nóng)田土按體積比2∶5∶13 均勻混合而成）。裝置由蠕動(dòng)泵泵入模擬生活污水，在土壤表層下65 cm 處設(shè)置布水管進(jìn)行散水，裝置底部有出水。

圖1 SWIS 模擬裝置

每套裝置從上往下設(shè)置6 個(gè)土壤取樣口，平時(shí)密封，只有采樣時(shí)打開，快速采樣，采樣完畢即刻關(guān)閉。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

將葡萄糖（C6H12O6）、氯化銨（NH4Cl）、硝酸鉀（KNO3）、亞硝酸鈉（NaNO2）、磷酸二氫鉀（KH2PO4）按一定比例配制成模擬生活污水，在水力負(fù)荷為0.14 m3/（m2·d）的條件下，控制布水期和落干期各12 h。待系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后，開始計(jì)算運(yùn)行時(shí)間，分別在運(yùn)行10，20，30 d 時(shí)，于每個(gè)取樣口取5 g 土壤，混合均勻后置于離心管中進(jìn)行預(yù)處理，每個(gè)取樣口取2個(gè)平行樣。

取樣之后，迅速用液氮對(duì)樣品進(jìn)行滅活，之后采用純甲醇進(jìn)行溶液提取，每次提取使用純甲醇10 mL，每個(gè)樣品提取3 次，將提取液合并在一起，置于真空中旋干，用1 mL 甲醇復(fù)溶，用離心機(jī)進(jìn)行離心處理10 min，吸取上清液，裝入1.5 mL 進(jìn)樣瓶，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，待上機(jī)檢測(cè)，檢測(cè)采用超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（UPLC-MS）。

3 結(jié)果與討論

3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

對(duì)土樣中代謝產(chǎn)物進(jìn)行UPLC-MS 分析后，對(duì)所得色譜質(zhì)譜中的波譜信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理，處理過(guò)程包括信息提取、濾噪、去卷積及歸一化等。最終將波譜信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)集中含有檢測(cè)到的513 種化合物，其中的部分化合物見表1。

表1 檢測(cè)到的部分化合物

3.2 PCA 和PLS－DA 分析

對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析，主要方法有主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）［6］。PCA 分析是一種通過(guò)降維將多個(gè)變量組成一組新變量，再?gòu)闹羞x取2～3 個(gè)變量（二維平面圖或三維平面圖），以更多地反映原有變量信息的分析方法，通過(guò)分析可以發(fā)現(xiàn)觀測(cè)變量與檢測(cè)變量之間存在相關(guān)性或者差異性，見圖2。

圖2 PCA 得分圖

通常進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)選取的是VIP＞1 的數(shù)據(jù)，但是由于本研究檢測(cè)出來(lái)的物質(zhì)中有215 種化合物的VIP＞1，因此，為了提高后續(xù)篩選的精確度并且縮小篩選的范圍，選擇1.5 作為篩選的VIP 臨界值。運(yùn)用R 語(yǔ)言進(jìn)行作圖，以運(yùn)行時(shí)間為變量，以化合物峰面積為數(shù)據(jù)集，繪制出PCA 得分圖。如圖2 所示，10，20，30 d 的樣本點(diǎn)都能明顯分開，但是在原點(diǎn)附近3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣本未完全分離，且有一些樣本點(diǎn)有遠(yuǎn)離模型組的趨勢(shì)。

為了得到更好的樣本顯著差異性，對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行PLS-DA 分析。PLS-DA 分析是一種常用的有監(jiān)督模式多變量統(tǒng)計(jì)分析方法，將各組強(qiáng)行分類，以便發(fā)現(xiàn)不同組間的異同點(diǎn)。尤其是對(duì)于差異性不明顯的樣品，通過(guò)PCA 分析難以區(qū)分樣品的差異性，采用PLS-DA 能更好地發(fā)現(xiàn)物質(zhì)間的相關(guān)性和差異性。如圖3 所示，在PLS-DA 得分圖中，10，20，30 d的絕大部分樣本點(diǎn)已分離，僅有個(gè)別樣本點(diǎn)有遠(yuǎn)離模型組的趨勢(shì)。因此可知，SWIS 微生物的代謝物受運(yùn)行時(shí)間的長(zhǎng)短的影響，且不同運(yùn)行時(shí)段之間代謝情況存在顯著差異性。

圖3 PLS-DA 得分圖

3.3 代謝物篩選

以VIP＝1.5 為臨界值，共獲取化合物47 種，占所有化合物的9.2%，說(shuō)明通過(guò)VIP 得到的潛在代謝標(biāo)志物之前存在差異性。對(duì)這47 種潛在代謝標(biāo)志物進(jìn)行結(jié)構(gòu)推導(dǎo)，過(guò)程包括精確分子量確定、多級(jí)質(zhì)譜碎片推導(dǎo)結(jié)構(gòu)、METLIN 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配、保留時(shí)間及相關(guān)性分析等。在經(jīng)過(guò)METLIN 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配后，保留與微生物相關(guān)的代謝產(chǎn)物，最終得到11 種潛在代謝標(biāo)志物，見表2。

表2 潛在代謝標(biāo)志物

3.4 代謝通路分析

利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選獲得的11 種化合物進(jìn)行檢索，得到相應(yīng)化合物的代謝通路圖，可以直觀地展現(xiàn)代謝產(chǎn)物的形成過(guò)程及其在代謝過(guò)程中的相互作用。代謝通路圖將物質(zhì)與代謝過(guò)程及其表達(dá)的基因用方框與連線表示出來(lái)，具體地表現(xiàn)出化合物的形成、酶催化反應(yīng)等，將代謝通路圖與生物學(xué)注釋結(jié)合，可明確代謝物的形成過(guò)程。共檢索到3 種化合物的已知代謝通路，見表3。

表3 物質(zhì)及其對(duì)應(yīng)的KEGG 編號(hào)

以2-聚異戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌（2-Polyprenyl-6-methoxy-1，4-benzoquinone）為例，分析其微生物代謝過(guò)程。如圖4 所示，該化合物是一種聚異戊烯基苯醌，是輔酶Q（Coenzyme Q）的代謝前體，在沙門氏菌中有檢出［7］。

圖4 2-聚異戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌的結(jié)構(gòu)示意

其代謝通路如圖5 所示。

圖5 2-聚異戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌的代謝通路

2-聚異戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌的代謝起點(diǎn)為L(zhǎng)-酪氨酸（L-Tyrosine），L-酪氨酸在酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為3-（4-羥基苯基）丙酮酸（3-4-Hydroxyphenylpyruvate），繼而在羥苯基丙酮酸還原酶作用下還原成（R）-3-（4-羥基苯基）乳酸［（R）-3-（4-Hydroxyphenyl）lactate］，然后脫水生成4-羥基肉桂酸（4-Hydroxycinnamic acid），又在輔酶A 作用下生成4-羥基苯甲酸脂（4-Hydroxybenzoic acid）。接著，4-羥基苯甲酸的代謝有兩種途徑：

途徑1，在轉(zhuǎn)移酶Coq2 的作用下轉(zhuǎn)化為4-羥基-3-聚異戊烯基苯甲酸酯（4-Hydroxy-3-polyprenylbenzoate），然后在Coq3，Coq6，Coq5 等轉(zhuǎn)移酶的作用下經(jīng)過(guò)數(shù)次轉(zhuǎn)化，最終轉(zhuǎn)化為輔酶Q，其中，2-聚異戊烯基-3-甲基-6-甲氧基-1，4-苯醌是轉(zhuǎn)化過(guò)程中的一個(gè)中間產(chǎn)物（圖5）。

途徑2，在轉(zhuǎn)移酶UbiA 的作用下轉(zhuǎn)化為4-羥基-3-聚異戊烯基苯甲酸酯，然后在UbiD，UbiX，UbiI 等轉(zhuǎn)移酶、羧化酶、羥化酶的作用下經(jīng)過(guò)數(shù)次轉(zhuǎn)化，最終轉(zhuǎn)化為輔酶Q，同樣，2-聚異戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌是轉(zhuǎn)化過(guò)程中的一個(gè)中間產(chǎn)物。

4 結(jié)論

本研究對(duì)一組基于UPLC-MS 檢測(cè)方法的代謝物檢出數(shù)據(jù)，建立了PLS-DA 模型，分析了SWIS 中代謝產(chǎn)物對(duì)苯醌在穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)的出現(xiàn)規(guī)律。從檢測(cè)出的化合物中篩選得到了11 種潛在代謝標(biāo)志物，其中包括己基谷氨酸（Caproyl glutamic acid）、油酸基谷氨酸（Oleoyl glutamic acid）、2-聚異戊烯基-6-甲氧基-1，4-苯醌等，利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)微生物產(chǎn)物對(duì)苯醌的代謝途徑進(jìn)行了具體的分析，闡明了其代謝過(guò)程和關(guān)鍵因子。