左西孟旦聯(lián)合高容量血液濾過對(duì)膿毒癥心肌損傷患者內(nèi)毒素、神經(jīng)內(nèi)分泌激素和炎癥指標(biāo)的影響

呂品 牛曉娟 陳霞 周超 李建英

膿毒癥在我國乃至全球發(fā)病率居高不下，是造成院內(nèi)重癥科室死亡率增高的主要原因之一[1,2]。心肌損傷則是膿毒癥最常見的并發(fā)癥，多數(shù)膿毒癥患者合并心功能不全，最終導(dǎo)致多臟器衰竭，病死率高[3,4]。研究顯示，組織灌注不足導(dǎo)致的全身性炎性反應(yīng)及其引發(fā)的器官功能障礙是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制，其中炎癥信號(hào)通路的激活是膿毒癥誘發(fā)心肌損傷和循環(huán)衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5,6]。高容量血液濾過(HVHF)是治療膿毒癥的主要方式，能夠有效清除毒素，抑制炎性反應(yīng)，但療效有限[7]。左西孟旦是一種新型鈣離子增敏劑，在多種心臟疾病的治療中被證實(shí)具有強(qiáng)心、擴(kuò)血管作用[8]。本研究探討了左西孟旦聯(lián)合HVHF對(duì)膿毒癥心肌損傷患者內(nèi)毒素、神經(jīng)內(nèi)分泌激素和炎癥指標(biāo)的影響，并以Toll樣受體4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路為靶點(diǎn)探討其治療機(jī)制。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2016年1月至2019年1月我院收治的膿毒癥心肌損傷患者60例納入研究范圍，隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組30例。對(duì)照組男18例，女12例；年齡41～72歲，平均(56.18±7.05)歲；治療組男20例，女10例；年齡42～68歲，平均(54.76±6.32)歲。2組基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，且心肌酶譜異常，超聲檢查顯示左心室射血分?jǐn)?shù)下降>50%，提示伴有心肌損傷[10]；(2)患者自愿加入本研究，且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有心絞痛、心肌炎、心肌梗死等基礎(chǔ)心臟疾病者；(2)重要臟器功能障礙者；(3)消化道潰瘍、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病患者；(4)惡性腫瘤患者；(5)對(duì)左西孟旦過敏者。

1.3 治療方法 2組均給予營養(yǎng)支持、機(jī)械通氣、抗感染、糾正水電解質(zhì)紊亂、去甲腎上腺素維持血壓等基礎(chǔ)治療。對(duì)照組實(shí)施早期HVHF治療，股靜脈或頸內(nèi)靜脈穿刺、留管，建立血管通路，采用床邊血液透析機(jī)進(jìn)行血液濾過治療，20 h/d，持續(xù)6 d；治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用左西孟旦注射液(成都圣諾生物制藥有限公司)，首負(fù)荷劑量12 μg/kg，靜脈注射時(shí)間≥10 min，隨后維持量0.1 μg·kg-1·min-1靜脈滴注24 h，2 h后調(diào)整為0.2 μg·kg-1·min-1，持續(xù)靜脈滴注。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 內(nèi)毒素:采集患者空腹靜脈血5 ml，離心取上清，采用微生物快速檢測儀測定血清內(nèi)毒素。

1.4.2 神經(jīng)內(nèi)分泌激素:采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測定血清皮質(zhì)醇(Cor)、腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、去甲腎上腺素(NE)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)。

1.4.3 炎癥指標(biāo):采用血球計(jì)數(shù)儀測定白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)；采用全自動(dòng)生化分析儀測定血清降鈣素原(PCT)。

1.4.4 Real time-PCR:密度梯度離心法提取外周血單核細(xì)胞(PBMCs)，采用Real time-PCR測定PBMCs TLR4、NF-kB、SIRT1 mRNA表達(dá)。Trizol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1鏈，ABI 7300型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對(duì)值為2-ΔΔCt。

1.4.5 Western blot:提取PBMC總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入抗TLR4、NF-kB、SIRT1特異性一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，TBST洗膜3次。ECL化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。

2 結(jié)果

2.1 2組內(nèi)毒素比較 2組治療前內(nèi)毒素比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，2組治療后內(nèi)毒素均較治療前顯著降低(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)。見表1。

表1 2組內(nèi)毒素比較

2.2 2組神經(jīng)內(nèi)分泌激素比較 2組治療前Cor、ACTH、NE、AngⅡ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后Cor、ACTH、NE、AngⅡ均較治療前顯著降低(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)。見表2。

表2 2組神經(jīng)內(nèi)分泌激素比較

2.3 2組TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)比較 2組治療前TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)。見表3。

表3 2組TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子表達(dá)比較

2.4 2組炎癥指標(biāo)比較 2組治療前WBC、PCT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后WBC、PCT均較治療前顯著降低(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)。見表4。

表4 2組炎癥指標(biāo)比較

2.5 2組SIRT1表達(dá)比較 2組治療前SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)無差異(P>0.05)；2組治療后SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)均較治療前顯著升高(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)。見表5。

表5 2組SIRT1表達(dá)比較

3 討論

隨著致病菌生長繁殖，菌體裂解釋放大量內(nèi)毒素，導(dǎo)致全身過度炎性反應(yīng)，同時(shí)機(jī)體清除致病菌能力降低，從而誘發(fā)多臟器功能損害，這是導(dǎo)致膿毒癥病情加重的主要原因。且內(nèi)毒素水平可在一定程度上反映致病菌生長繁殖和感染嚴(yán)重程度。此外，WBC是反映炎性反應(yīng)程度的常用指標(biāo)，但特異性差。PCT是甲狀腺C細(xì)胞、腸道神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，正常情況下血清PCT水平較低，當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染、膿毒癥、多器官衰竭時(shí)細(xì)菌內(nèi)毒素能夠促進(jìn)PCT的合成和分泌，導(dǎo)致血清PCT水平增高，且與感染嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此，PCT已經(jīng)成為診斷感染、膿毒癥的重要指標(biāo)，較傳統(tǒng)指標(biāo)具有更高的敏感性、特異性。本研究結(jié)果顯示，2組治療前內(nèi)毒素、WBC、PCT比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后內(nèi)毒素、WBC、PCT均較治療前顯著降低(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)，說明膿毒癥患者存在明顯的炎性反應(yīng)，左西孟旦聯(lián)合HVHF能夠有效降低血清內(nèi)毒素水平，控制炎性反應(yīng)，從而減輕心肌損傷。

研究發(fā)現(xiàn)，TLR4/NF-κB信號(hào)通路在調(diào)控膿毒癥全身炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。TLR4是介導(dǎo)非特異性免疫應(yīng)答的一種跨膜糖蛋白，在單核巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型細(xì)胞膜中均有表達(dá)，其配體為革蘭陰性菌細(xì)胞壁成分脂多糖，通過MyD88依賴性和MyD88非依賴性途徑能夠激活NF-κB，后者轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核后與炎性因子啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，參與調(diào)控炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，造成炎性反應(yīng)進(jìn)一步放大并損害心肌組織[12]。基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，膿毒癥時(shí)心肌組織TLR4、NF-κB及炎性因子表達(dá)增高，提示心肌組織存在過度炎性反應(yīng)，而使用TLR4抑制劑能夠阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化，減輕心肌組織炎性反應(yīng)[13]。因此，以TLR4/NF-κB信號(hào)通路為靶點(diǎn)有可能降低或逆轉(zhuǎn)膿毒癥全身炎性反應(yīng)，進(jìn)而減輕心肌損傷。本研究結(jié)果顯示，2組治療前TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表達(dá)均較治療前顯著降低(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)，提示左西孟旦聯(lián)合HVHF治療膿毒癥心肌損傷能夠阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活，降低炎性因子的合成和分泌，從而減輕心肌損傷程度。

SIRT1是一種組蛋白去乙?；?，參與調(diào)控細(xì)胞分化、凋亡、自噬、炎性反應(yīng)等生理和病理過程[14]。多項(xiàng)研究表明，SIRT1表達(dá)下調(diào)與心肌肥厚、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病密切相關(guān)[15]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥小鼠心肌組織SIRT1表達(dá)降低，而恢復(fù)SIRT1表達(dá)能夠抑制NF-κB的活化，進(jìn)而減輕膿毒癥誘發(fā)的心肌損傷[16,17]。本研究結(jié)果表明，2組治療前SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)均較治療前顯著升高(P<0.05)，且治療組改善程度更明顯(P<0.05)，說明左西孟旦聯(lián)合HVHF治療膿毒癥心肌損傷能夠上調(diào)SIRT1表達(dá)，進(jìn)而抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活和炎性因子的分泌，減輕心肌損傷。

當(dāng)膿毒癥心肌損傷發(fā)生后，心肌細(xì)胞凋亡增多，進(jìn)而激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，導(dǎo)致應(yīng)激激素大量分泌，從而加重心肌損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，2組治療前Cor、ACTH、NE、AngⅡ比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組治療后Cor、ACTH、NE、AngⅡ均較治療前顯著降低(P<0.05)，且治療組更明顯(P<0.05)，說明左西孟旦聯(lián)合HVHF治療膿毒癥心肌損傷能夠抑制神經(jīng)內(nèi)分泌的激活，降低應(yīng)激激素分泌，保護(hù)心功能。

綜上所述，左西孟旦聯(lián)合HVHF治療膿毒癥心肌損傷能夠通過上調(diào)SIRT1的表達(dá)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的活化，抑制炎性反應(yīng)，并降低神經(jīng)內(nèi)分泌激素水平。