大別山區(qū)域樹舌靈芝和云芝抗氧化活性研究

陳頤輝

(信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽 464000)

多孔菌科真菌 (Polyporaceac) 隸屬于真菌界 (Fungi) 擔(dān)子菌門 (Basidiomycota) 擔(dān)子菌綱 (Basidiomycetes) 傘菌亞綱 (Agaricomycetidae) 多孔菌目 (Polyporales)[1]，自然界已知的多孔菌科真菌約有500多種，中國發(fā)現(xiàn)300余種。多孔菌科真菌是一類研究利用較多的大型真菌，擁有較高的食藥用價(jià)值，如可食用的灰樹花、地花菌、硫磺菌等；常被用作中藥材的靈芝，紫芝，茯苓、豬苓等[2]，含有較強(qiáng)生理活性，具有滋補(bǔ)、健腦等功效，且具有良好的免疫活性、抗腫瘤活性、抗氧化活性等的藥用價(jià)值[3]。

大別山地區(qū)因其富饒的植被資源和適宜的環(huán)境，蘊(yùn)含豐富的多孔菌科真菌資源，各學(xué)者也有針對(duì)其中菌種的藥理活性進(jìn)行研究，但相關(guān)研究多集中于對(duì)靈芝(Ganoderma Lucidum Karst)，紫芝(Ganoderma sinense)等的多糖，萜類化合物[3-4]，其他菌株與成分研究則相對(duì)較少。多孔菌科真菌的抗氧化物可作用于清除自由基，減少脂質(zhì)過氧化物的形成，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化損傷的能力，防治腫瘤等[5]，同樣具有巨大的研究潛力。樹舌靈芝具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)抗病毒等功效，云芝具有恢復(fù)和增強(qiáng)帶腫瘤機(jī)體的免疫功能、防癌抗癌等功效[6-7]，但其抗氧化活性的特點(diǎn)目前研究較少。

本研究選擇大別山地區(qū)野生樹舌靈芝和云芝作為實(shí)驗(yàn)材料，以信陽農(nóng)林學(xué)院人工培養(yǎng)靈芝為對(duì)照材料，分離培養(yǎng)獲得樹舌靈芝和云芝的純種培養(yǎng)物；通過研究超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶的酶活性來探究其抗氧化活性特點(diǎn)，進(jìn)而挖掘大別山地區(qū)多孔菌科真菌的種質(zhì)資源特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

樹舌靈芝與云芝栓孔菌均來自于大別山區(qū)域野外采摘，選擇信陽農(nóng)林學(xué)院人工栽培靈芝為對(duì)照。二硫代對(duì)二硝甲基苯甲酸，鄰苯三酚，青霉素和鏈霉素等試劑均為分析純。

5415D微型離心機(jī)、UV752N紫外可見分光光度計(jì)、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、DNP電熱恒溫培養(yǎng)箱、MS105DU電子分析天平、QHZ - 98A全溫度振蕩培養(yǎng)箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)及粗酶液制備

將樹舌靈芝、云芝及靈芝表面沖洗干凈，再用無菌水沖洗2～3次。無菌環(huán)境下，選取菌柄和菌蓋邊緣間的中心位置，用無菌手術(shù)刀切割0.3cm左右的組織塊，壓入加有青霉素和鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)至直徑為2～3cm時(shí)，挑選少量菌絲在PDA培養(yǎng)基上純化2～4次，將純種菌絲轉(zhuǎn)接至PDA液體培養(yǎng)基中，25℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)12天[8]。無菌抽濾得到菌絲體，各稱取材料0.1g，加入預(yù)先配制過的pH值7.8的0.05mol/L磷酸鈉緩沖液5mL，冰浴研磨。在4℃ 10 000r/min高速離心15min，收集上清液，隨后用以測(cè)定酶活性[9]。

1.2.2 酶活性的測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定SOD活性[9]，參照郝俊江等[9]的方法測(cè)定CAT活性，參照王遲早等[10]的方法測(cè)定GPX活性，每組試驗(yàn)重復(fù)三次，取數(shù)據(jù)平均值。

用Excel軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 超氧化物歧化酶活性

超氧化物歧化酶(SOD)是一類金屬酶,廣泛存在于生物體內(nèi)，可以特異性地催化超氧陰離子的歧化反應(yīng)[11]。

由圖1可知樹舌靈芝和云芝的SOD活性均高于對(duì)照，其中云芝的SOD活性最高，達(dá)到85.40U/g，高于對(duì)照14.5%，樹舌靈芝的SOD活性同樣高于對(duì)照10.4%。

圖1 樹舌靈芝、云芝與靈芝的超氧化物歧化酶活性對(duì)比 (單位：U/g)

2.2 過氧化氫酶活性

過氧化氫酶(CAT)可以阻止H2O2與細(xì)胞中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基進(jìn)一步生成羥自由基，從而防止自由基對(duì)細(xì)胞的損傷[12]。

由圖2可知實(shí)驗(yàn)材料的樹舌靈芝和云芝的CAT活性均高于對(duì)照組材料，酶活性分別為38.63U/g·min，39.67U/g·min，分別高于對(duì)照6.4%、9.3%。

圖2 樹舌靈芝、云芝與靈芝的過氧化氫酶活性對(duì)比(單位：U·g-1·min-1)

2.3 谷胱甘肽過氧化物酶活性

谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)是Mills等發(fā)現(xiàn)一種自由基捕獲劑，具有很典型的抗氧化活性[11]。

由圖3可知，樹舌靈芝和云芝的GPX活性均高于對(duì)照組材料，其中樹舌靈芝的GPX活性最高，為56.79U/mL，高于對(duì)照11.0%，云芝的GPX活性53.70U/mL，同樣高于對(duì)照10.4%。

圖3 樹舌靈芝、云芝與靈芝的谷胱甘肽過氧化物酶活性對(duì)比 (單位：U/mL)

3 討論

從圖1可知，三種材料雖在同一培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但不同菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)不同，且根據(jù)趙丹等[11]試驗(yàn)可知隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)靈芝的SOD活性減退較快,而實(shí)驗(yàn)組的SOD活性均高于對(duì)照，這說明野外采摘的樹舌靈芝和云芝具有較強(qiáng)的SOD活性。付欣[6-7，13]等的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，樹舌靈芝和云芝相關(guān)酶的抗腫瘤活性更大，因此也可以間接證明其所含CAT和GPX活性也相應(yīng)要高。但是本實(shí)驗(yàn)主要研究的是菌絲體時(shí)期的三種酶活性，根究郝俊江[7]等的研究，可以發(fā)現(xiàn)不同菌種在不同生長(zhǎng)周期的酶活性存在差異，因此本次試驗(yàn)只能證明菌絲體時(shí)期的三種酶活性差異，具體其他生長(zhǎng)周期的SOD、CAT、GPX活性還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究首次對(duì)大別山區(qū)域野生樹舌靈芝和云芝的抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明樹舌靈芝和云芝菌絲體的SOD、CAT和GPX酶活性均高于對(duì)照靈芝，而云芝的SOD和CAT活性又較之大于樹舌靈芝，這說明大別山區(qū)域的野生多孔菌科真菌具有良好的抗氧化活性。然而，本試驗(yàn)只探究了多孔菌科真菌菌絲體某一生長(zhǎng)階段的酶活性差異，但菌絲體不同生長(zhǎng)時(shí)期其酶活性也存在差異，因此今后可針對(duì)菌絲體整個(gè)生長(zhǎng)周期，甚至子實(shí)體階段的抗氧化活性進(jìn)行研究。