鈴鐺刺花提取物增強(qiáng)機(jī)體免疫力及運(yùn)動(dòng)抗疲勞作用研究

（寧波職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江 寧波 315800）

鈴鐺刺花是一種學(xué)名為“鹽豆木”的花，主要分布在我國(guó)西北及新疆地區(qū)鹽堿荒漠地的一種灌木，該植物喜光、耐鹽堿、耐干旱，是良好的固沙、改良鹽堿地的樹種。在中國(guó)西北部長(zhǎng)期用作高產(chǎn)牧草，其花和嫩葉可供食用，味道鮮美，是當(dāng)?shù)厝讼矏鄣拇杭臼巢?，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。研究鈴鐺刺花提取物對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫力及運(yùn)動(dòng)抗疲勞作用，可增強(qiáng)人體對(duì)疾病的抵抗力。從天然產(chǎn)物中篩選抗疲勞和增強(qiáng)機(jī)體免疫作用的有效成分、研究其作用機(jī)制具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1、實(shí)驗(yàn)材料

1.1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠SPF級(jí)，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(新)2011-0004。

1.2、實(shí)驗(yàn)試劑

鈴鐺刺花提取物(浸膏)，由昌吉職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院提供。小鼠血清尿素氮檢測(cè)試劑盒，小鼠全血乳酸檢測(cè)試劑盒，小鼠肝糖原含量檢測(cè)試劑盒，均為南京建成生物工程研究所提供。

1.3、實(shí)驗(yàn)器材

多級(jí)閃蒸鍋JMF-320-A；中藥多功能提取罐。

DC-TQ-30；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ；Sartorius CP225D型電子天平；小鼠灌胃器；爬桿器具：自制，直徑1cm，長(zhǎng)25cm的玻璃棒，砂紙打磨后上端固定在木板上制成爬桿架，下端懸空，玻璃棒下端距離地面30cm，地面鋪上2cm左右的海綿以防止小鼠落下摔傷。游泳箱：根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》要求自制。紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。全自動(dòng)生化分析儀，日本 Beckman Coul-ter K·K。

2、實(shí)驗(yàn)方法

2.1、實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)條件設(shè)施齊全，將邀請(qǐng)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)及化學(xué)實(shí)驗(yàn)方面的老師進(jìn)行技術(shù)指導(dǎo)，利用學(xué)員化工學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，為確保本次課題能順利的完成作出基本保障。

2.2、鈴鐺刺花提取液的制備

鈴鐺刺花提取物(浸膏)，氣味清香，粘稠的棕褐色流浸膏，由昌吉職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院提供。樣品用蒸餾水稀釋成最大濃度2g·mL-1(以不堵塞灌胃針為標(biāo)準(zhǔn))，置4℃冰箱備用。

2.3、鈴鐺刺花提取液抗疲勞作用

（1）爬桿實(shí)驗(yàn)。

取小鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，隨機(jī)分為4組，空白組，鈴鐺刺花高、中、低劑量組(4、2和1)g·kg-1，每組 10只。鈴鐺刺花各劑量組分別灌胃鈴鐺刺花提取液，1日1次，1次0.2ml/10g小鼠，空白組同樣每日灌胃0.2ml/10g小鼠的生理鹽水，連續(xù)10天。試驗(yàn)前訓(xùn)練小鼠兩天，使其學(xué)會(huì)爬桿。末次給予受試物30min后，將小鼠放在長(zhǎng)25cm、直徑1cm、光滑的有機(jī)玻璃竿上，使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)，記錄小鼠由于肌肉疲勞從玻璃棒上跌落下來的時(shí)間，第3次跌落時(shí)終止實(shí)驗(yàn)，累計(jì)3次的時(shí)間作為爬桿時(shí)間。延長(zhǎng)率=(給藥組跌落時(shí)間-空白對(duì)照組跌落時(shí)間/空白對(duì)照組跌落時(shí)間)×100%。

（2）游泳實(shí)驗(yàn)。

小鼠于末次灌胃后30min，將尾根部負(fù)荷5%體質(zhì)量鉛塊的小鼠投入自制水槽中游泳，水深30cm，水溫30℃，尾部負(fù)重沙袋，同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記錄小鼠游泳開始至頭部沒入水面以下8s不再上浮的時(shí)間，作為小鼠負(fù)重游泳時(shí)間。

2.4、小鼠游泳后血清尿素氮、血乳酸含量測(cè)定

連續(xù)灌胃鈴鐺刺花提取液10天，于末次給藥30min后(禁食不禁水)，將小鼠放入水深30cm，水溫30℃水槽中，不負(fù)重游泳90min，休息60min后撥眼球取血0.5mL，加肝素抗凝后，以3000r·min－1離心15min，取血清，按照試劑盒的方法測(cè)定血清中的乳酸和尿素氮含量。

2.5、小鼠游泳后肝糖原含量測(cè)定

連續(xù)灌胃鈴鐺刺花提取液10天，于末次給藥30min后(禁食不禁水)，置小鼠放入水深30cm，水溫30℃水槽中，不負(fù)重游泳90min，游泳后立即處死，小鼠肝臟用生理鹽水漂洗，再用濾紙吸干，稱重，然后加入堿液破壞組織保留糖原，按樣本重量(9mg)∶堿液體積(μL)=1:3，一起加入試管中，用冰箱保鮮膜將管口扎起，以防水分蒸發(fā)，在膜上用針頭扎一小孔，以便氣體熱脹冷縮，沸水浴煮20min，流水冷卻。按試劑盒要求將糖原水解液進(jìn)一步制備成糖原檢測(cè)液，測(cè)定肝糖原含量。

2.6、統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnett比較。兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent-Sample T Test)。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1、鈴鐺刺花提取液最大耐受量計(jì)算

鈴鐺刺花提取液每人每日推薦量為12g，相當(dāng)于0.2g.kg-1（成人體重以60kg計(jì)），鈴鐺刺花流浸膏濃度為2g·ml-1生藥，灌胃體積為0.02mL.g-1BW，每天灌胃3次，則計(jì)算出小鼠的最大耐受劑量MTD為：120g生藥/kg小鼠，根據(jù)計(jì)算公式得出小鼠MTD相當(dāng)于人用量的倍數(shù)為(小鼠體重以20g計(jì))：

鈴鐺刺花急性毒性在測(cè)不出LD 50的情況下，進(jìn)行了最大耐受量研究，每天給藥3次的最大給藥劑量，體重均有不同程度的增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)小鼠進(jìn)行大體病理學(xué)觀察，未發(fā)現(xiàn)有明顯病理改變，全程實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無死亡，鈴鐺刺花提取液對(duì)小鼠的MTD為120g生藥/kg小鼠，相當(dāng)于成人臨床日用量的300倍，結(jié)果證明動(dòng)物完全能耐受，未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，表明鈴鐺刺花食用是安全的。

3.2、鈴鐺刺花提取液對(duì)耐力時(shí)間的影響

在爬桿試驗(yàn)當(dāng)中鈴鐺刺花高和中劑量組小鼠的爬桿時(shí)間與空白對(duì)照組相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，分別使小鼠跌落的時(shí)間延長(zhǎng)了46.70%和47.53%，低劑量組雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但也使小鼠的跌落時(shí)間延長(zhǎng)了13.26%；在抗疲勞游泳實(shí)驗(yàn)中：鈴鐺刺花高和中劑量組小鼠的游泳時(shí)間與空白對(duì)照組相比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，但無劑量依賴性趨勢(shì)，但此實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說明該藥能提高抗疲勞的能力(見表1)。

表1 鈴鐺刺花提取液對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響(x±s)

3.3、鈴鐺刺花提取液疲勞代謝物指標(biāo)的影響

與正常對(duì)照組比較，各給藥組運(yùn)動(dòng)后小鼠的血乳酸含量均有降低，其中中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；與正常對(duì)照組比較，各給藥組運(yùn)動(dòng)后小鼠的血清尿素氮有降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各給藥組運(yùn)動(dòng)后小鼠的肝糖原含量均高于正常對(duì)照組，其中中劑量組和高劑量組與對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.01)；表明鈴鐺刺提取物可以降低實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)后的乳酸和尿素氮的含量，提高實(shí)驗(yàn)小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原的含量(見表2)。

表2 鈴鐺刺花提取液對(duì)運(yùn)動(dòng)后小鼠疲勞代謝物指標(biāo)的影響(x±s)

4、討論

本試驗(yàn)設(shè)定的鈴鐺刺花提取物每人每日推薦量為12g，相當(dāng)于0.2g·kg-1(成人體重以60kg計(jì))；最大給藥量試驗(yàn)中鈴鐺刺提取物，濃度為 2g·m-1，灌胃體積為 0.02ml·g-1，每天灌胃 3 次，則計(jì)算出小鼠的藥物用量為：120g@kg-1，MTD相當(dāng)于成人臨床日用量的300倍，按體重計(jì)算，小鼠1天最大給藥量相當(dāng)于成人臨床日用劑量的100倍以上則較為安全，表明鈴鐺刺提取物毒性低，動(dòng)物完全能耐受，未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)。《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中對(duì)緩解體力疲勞功能的判定，認(rèn)為負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，血清乳酸、尿素、肝糖元/肌糖元三項(xiàng)生化指標(biāo)中任二項(xiàng)指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞的作用。本實(shí)驗(yàn)通過小鼠給藥10天后，與空白組比較，鈴鐺刺花提取液中、高劑量均能明顯延長(zhǎng)小鼠的游泳和爬竿時(shí)間，3個(gè)劑量組均能降低運(yùn)動(dòng)后小鼠血乳酸含量，其中中劑量組(2g·kg-1)和高劑量組(4g·kg-1)與對(duì)照組的差異顯著；同時(shí)3個(gè)劑量組均能提高運(yùn)動(dòng)后小鼠肝糖原的含量，其中中劑量組(2g·kg-1)和高劑量組(4g·kg-1)與對(duì)照組的差異顯著；與正常對(duì)照組比較，各給藥組運(yùn)動(dòng)后小鼠的血清尿素氮有降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明鈴鐺刺花提取液可以顯著緩解運(yùn)動(dòng)后小鼠的疲勞。

綜上所述，鈴鐺刺花是一種安全的、有抗疲勞作用的植物，鈴鐺刺花的提取物對(duì)提高機(jī)體免疫力及運(yùn)動(dòng)抗疲勞的作用。