miR-26b在肝硬化門靜脈高壓預后評估中的價值

張 群 李 濤 張禮杏

門靜脈高壓是肝硬化患者較為嚴重的并發(fā)癥之一，可誘發(fā)食管胃底靜脈曲張破裂出血、頑固性腹水、自發(fā)性細菌性腹膜炎、脾功能亢進及肝性腦病等，甚至可導致死亡[1-3]。門靜脈壓力在肝硬化門靜脈高壓患者的預后評估中具有重要意義[4]。肝靜脈壓力梯度與門靜脈壓力梯度有較高的相關(guān)性，被認為是反映門靜脈壓力的金標準[5-6]。但由于肝靜脈壓力梯度檢查為有創(chuàng)性檢查，且費用昂貴，暫未在臨床上推廣應用[7]。因此，探究反映肝硬化門靜脈高壓患者預后的生物標志物意義重大。有研究表明，miR-26b過表達可靶向人類平衡型核苷轉(zhuǎn)運蛋白1，抑制Rho亞家族蛋白A/Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1信號轉(zhuǎn)導通路表達，降低經(jīng)膽總管結(jié)扎誘導的肝硬化門靜脈高壓大鼠的門靜脈壓力，并改善肝纖維化[8]。目前關(guān)于miR-26b在肝硬化門靜脈高壓患者血清中的表達水平及其與預后關(guān)系的報道較少。本文對此開展研究，以期為肝硬化門靜脈高壓的預后評估提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2017年1月至2018年12月在太和縣中醫(yī)院確診為肝硬化門靜脈高壓的127例患者作為研究對象。參照《肝硬化門靜脈高壓食管胃靜脈曲張出血防治指南(2015)》[9]對患者進行診斷。納入標準：(1)有慢性乙型肝炎病毒、慢性丙型肝炎病毒感染史，感染時間長于6個月；(2)首次經(jīng)影像學檢查或肝活組織病理學檢查確診為肝硬化，并伴有門靜脈高壓；(3)簽署了知情同意書。排除標準：(1)門靜脈高壓性胃腸??；(2)嚴重肝、腎功能障礙；(3)合并嚴重感染；(4)先天性肝內(nèi)膽管囊性擴張或膽道阻塞性擴張；(5)合并惡性腫瘤。127例肝硬化門靜脈高壓患者中男性85例，女性42例，年齡為28～70歲，平均年齡為(53.59±8.54)歲；其中慢性乙型肝炎患者114例，慢性丙型肝炎患者13例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 臨床資料收集

收集受試者的年齡、性別、肝硬化病因、Child-Pugh分級、肌酐、白蛋白、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和膽紅素水平。采用7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)檢測肌酐水平，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測ALT和AST水平，采用免疫比濁法檢測白蛋白水平，采用釩酸鹽氧化法檢測膽紅素水平。

1.3 血清miR-26b表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR法檢測所有患者血清中miR-26b的表達水平[10]。步驟如下：(1)抽取患者晨起肘部靜脈血10 mL，3 500 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，提取離心后上清液；(2)將Trizol試劑滴加至上清液中，提取血清中總RNA；(3)用紫外分光光度計檢測總RNA純度；(4)將總RNA加至Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒中進行反轉(zhuǎn)錄反應，獲取cDNA；(5)用PCR儀擴增cDNA，反應條件為95 ℃預變性5 min，之后95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共計40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR-26b的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 預后隨訪及評價

采用電話隨訪、復診等方式了解肝硬化門靜脈高壓患者的預后情況。于患者出院后1個月開始隨訪，末次隨訪時間為2019年12月23日。本研究將食管胃底靜脈曲張破裂出血、中量或高量腹腔積液(>500 mL)、自發(fā)性腹膜炎、肝性腦病及上述并發(fā)癥誘發(fā)的死亡定義為預后不良。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 預后良好組與預后不良組的基本資料比較

127例肝硬化門靜脈高壓患者中共有53例(41.73%)預后不良，其中食管胃底靜脈曲張破裂出血44例(34.65%)，中量腹腔積液5例(3.94%)，高量腹腔積液2例(1.57%)，并發(fā)自發(fā)性腹膜炎2例(1.57%)。兩組患者在性別、白蛋白、ALT和AST水平方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。預后不良組患者的年齡、慢性丙型肝炎占比、Child-Pugh分級B級占比、肌酐和膽紅素水平均高于預后不良組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組的基本資料比較

2.2 兩組血清中miR-26b表達水平比較

預后不良組患者血清中miR-26b相對表達量為4.30±1.29，低于預后良好組(6.31±1.56)，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.691，P<0.001)。

2.3 miR-26b評估肝硬化門靜脈高壓患者預后的價值

miR-26b評估肝硬化門靜脈高壓患者預后的ROC曲線下面積(AUC)為0.838(95%CI：0.762～0.898)，最大約登指數(shù)為0.520，其所對應的最佳截斷點、敏感度和特異度分別為4.52、64.15%和87.84%。見圖1。

2.4 影響肝硬化門靜脈高壓患者預后的相關(guān)因素分析

將肝硬化門靜脈高壓患者的預后情況作為因變量，將可能影響肝硬化門靜脈高壓患者預后的相關(guān)因素如年齡、肝硬化病因、Child-Pugh分級、肌酐、膽紅素和miR-26b相對表達量作為自變量納入多因素Logistic回歸分析(納入標準為單因素分析中P<0.05)，結(jié)果顯示年齡、肝硬化病因、Child-Pugh分級及miR-26b相對表達量與肝硬化門靜脈高壓患者的預后密切相關(guān)(P<0.05)，見表3。

圖1 miR-26b評估肝硬化門靜脈高壓患者預后的ROC曲線

表3 影響肝硬化門靜脈高壓患者預后的多因素Logistic回歸分析

3 討論

微RNA(miRNA)是一類由18～24個核苷酸組成的不具備編碼蛋白質(zhì)功能的單鏈RNA[11]。據(jù)報道，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNA可參與細胞的增殖、自噬、遷移及凋亡等病理生理過程[12-14]。miR-26b作為miRNA中一員，已被報道其與乳腺癌[15]、肺癌[16]、上皮性卵巢癌[17]和黑素瘤[18]等有關(guān)。Jiang等[19]研究證實了miR-26b可抑制Mcl-1基因表達，加速腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TRAIL)誘導的肝癌細胞凋亡。目前關(guān)于miR-26b與肝硬化門靜脈高壓患者預后關(guān)系的報道較少。

本研究采用實時熒光定量PCR法檢測肝硬化門靜脈高壓患者血清miR-26b的表達水平，發(fā)現(xiàn)預后不良組患者血清中miR-26b的相對表達量低于預后良好組，提示血清miR-26b的表達水平可能與肝硬化門靜脈高壓患者的預后密切相關(guān)。隨后，本研究構(gòu)建了miR-26b診斷肝硬化門靜脈高壓患者預后的ROC曲線，結(jié)果顯示miR-26b評估肝硬化門靜脈高壓患者預后的ROC AUC、敏感度和特異度分別為0.838、64.15%和87.84%，提示miR-26b對肝硬化門靜脈高壓患者預后評估具有較高價值，特異度較高，但敏感度較低。為進一步明確miR-26b與肝硬化門靜脈高壓患者預后的關(guān)系，本研究采用單因素及多因素Logistic回歸分析了可能影響肝硬化門靜脈高壓患者預后的相關(guān)因素，結(jié)果顯示年齡、肝硬化病因、Child-Pugh分級及miR-26b相對表達量與肝硬化門靜脈高壓患者的預后密切相關(guān)。周昊等[4]研究表明年齡≥60歲或伴有慢性丙型肝炎的肝硬化門靜脈高壓患者的門靜脈壓力較高，推測患者預后不良的原因可能是年齡較大或伴有慢性丙型肝炎肝硬化，兩者均會升高門靜脈壓力，易誘發(fā)食管胃底靜脈曲張破裂出血、肝性腦病等并發(fā)癥。Child-Pugh分級可反映肝臟的損傷情況，對肝硬化患者的預后評估具有重要價值[20]。miR-26b相對表達量與肝硬化門靜脈高壓患者的預后密切相關(guān)，推測其原因是miR-26b過表達可降低膽總管結(jié)扎誘導的肝硬化門靜脈高壓大鼠的門靜脈壓力，從而改善肝硬化[8]，其表達水平可反映肝臟損傷情況，進而預示患者預后。

綜上所述，肝硬化門靜脈高壓預后不良患者的血清miR-26b表達水平低于預后良好者。檢測肝硬化門靜脈高壓患者血清miR-26b表達水平有助于評估預后情況。年齡較大、患有慢性丙型肝炎、Child-Pugh分級為B級或miR-26b表達水平較低的肝硬化門靜脈高壓患者的預后不良風險較高。本研究的不足之處在于為單中心研究，納入的患者均為本地區(qū)患者，可能會對研究結(jié)果造成一定偏倚，下一步將納入多地區(qū)患者，開展多中心研究。