血清miR-29a在膽石癥患者中的表達水平及意義

盧的一 郭茂東 葉曉華

膽石癥是臨床常見病和多發(fā)病。近年來，隨著人們飲食習慣及飲食結(jié)構(gòu)的變化，膽石癥的發(fā)病率逐年升高[1]。膽石癥臨床表現(xiàn)為上腹部不適、隱痛、惡心嘔吐、發(fā)熱寒戰(zhàn)等[2]，按照嚴重程度可分為單純性膽石癥和復雜性膽石癥。復雜性膽石癥病變部位的炎性反應常較為嚴重，行手術(shù)治療時難以準確劃定病灶，導致醫(yī)源性膽道損傷的發(fā)生率升高[3]。目前，臨床上常用影像學方法診斷復雜性膽石癥[4-5]，但Gyedu等[6]認為影像學檢查在診斷復雜性膽石癥時的敏感度較低。膽石癥的發(fā)生、發(fā)展與膽汁淤積后膽固醇、卵磷脂及膽鹽等的水平異常密切相關(guān)[7-8]。有研究表明，miR-29a可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達介導膽汁淤積[9]，而膽汁淤積與膽石癥的發(fā)生、發(fā)展存在聯(lián)系。由此推測，miR-29a可能參與了膽石癥的病理生理過程。目前有關(guān)miR-29a與膽石癥之間關(guān)系的報道較少，本文就此開展研究，以期為臨床判斷膽石癥的嚴重程度提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2016年8月至2019年8月在金華市中心醫(yī)院接受治療的143例膽石癥患者作為研究對象。納入標準：(1)均經(jīng)CT或超聲診斷為膽石癥；(2)無梗阻性黃疸；(3)年齡≥18歲；(4)入組前未接受解痙止痛、抗感染等對癥治療；(5)簽署知情同意書。排除標準：(1)合并消化道惡性腫瘤；(2)嚴重心、肝、腎功能不全；(3)合并膽道感染、病毒性肝炎等疾病。膽石癥組中男性52例，女性91例，年齡為28～68歲，平均年齡為(46.72±5.64)歲，平均體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(22.05±3.30)kg/m2。另選取本院同期140例健康體檢者作為對照組，其中男性55例，女性85例，年齡為30～65歲，平均年齡為(45.59±5.24)歲，平均BMI為(22.31±3.15)kg/m2。兩組在性別、年齡、BMI方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

收集受試者的年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心率、肝硬化、既往手術(shù)史、結(jié)石類型、腹腔積液，以及血清尿素氮、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平等資料。

采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測受試者血清miR-29a相對表達量。抽取受試者入組后空腹外周靜脈血10 mL，4 ℃下4 000 r/min離心15 min，分離上層血清，置于-20 ℃冰箱待測。采用TRIzol試劑(購自美國 Thermo Fisher公司)提取總RNA，將2 μg的總RNA添加至20 μL反應液中，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自美國 Thermo Fisher公司)反向轉(zhuǎn)錄合成cDNA，最后PCR擴增。反應條件：95 ℃ 預變性5 min，隨后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s，共45個循環(huán)。引物由美國Invitrogen公司合成，引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt表示miR-29a的相對表達量。

表1 引物序列

1.3 膽石癥的嚴重程度

143例膽石癥患者中有65例為單純性膽石癥，78例為復雜性膽石癥。檢查結(jié)果符合下列其中1項即可診斷為復雜性膽石癥：(1)膽囊嚴重纖維化或Calot三角粘連、瘢痕化、脂肪堆積；(2)膽囊前三角區(qū)及后三角區(qū)的腹部之間界限不清；(3)膽囊嚴重炎性水腫或萎縮[10]。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 膽石癥組與對照組的基本資料比較

膽石癥組與對照組在年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心率、血清尿素氮方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具體見表2。

表2 膽石癥組與對照組的基本資料比較

2.2 膽石癥組與對照組血清miR-29a相對表達量比較

膽石癥組患者血清miR-29a相對表達量為1.15±0.28，高于對照組(0.76±0.23)，差異有統(tǒng)計學意義(t=12.815，P<0.001)。

2.3 單純性膽石癥組與復雜性膽石癥組患者血清miR-29a相對表達量比較

單純性膽石癥組患者血清miR-29a相對表達量為0.91±0.26，低于復雜性膽石癥組(1.35±0.21)，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.726，P<0.001)。血清miR-29a預測復雜性膽石癥的ROC曲線下面積(AUC)、敏感度、特異度、最佳截斷點、最大約登指數(shù)分別為0.842(95%CI：0.771～0.897)、71.79%、84.62%、1.15、0.564。見圖1。

2.4 單純性膽石癥組與復雜性膽石癥組患者的基本資料比較

兩組在年齡、性別、高血壓、糖尿病、既往手術(shù)史、結(jié)石類型方面比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與復雜性膽石癥組相比較，單純性膽石癥組患者中肝硬化、腹腔積液占比以及血清TC、TG、LDL-C水平較低，HDL-C水平較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表3。

圖1 血清miR-29a預測復雜性膽石癥的ROC曲線

2.5 影響復雜性膽石癥發(fā)生的相關(guān)因素

本研究將既往手術(shù)史(無=0，有=1)、TC(<4.48 mmol/L=0，≥4.48 mmol/L=1)、肝硬化(否=0，是=1)、腹腔積液(否=0，是=1)、TG(<2.41 mmol/L=0，≥2.41 mmol/L=1)、LDL-C(<2.66 mmol/L=0，≥2.66 mmol/L=1)、HDL-C(>1.38 mmol/L=0，≤1.38 mmol/L=1)、miR-29a(<1.15=0，≥1.15=1)作為自變量，α入=0.05，α出=0.10，將膽石癥嚴重程度(單純性膽石癥=0，復雜性膽石癥=1)作為因變量納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示肝硬化、腹腔積液、TC、miR-29a與復雜性膽石癥的發(fā)生密切相關(guān)。見表4。

表3 單純性膽石癥組與復雜性膽石癥組患者的基本資料比較

表4 影響復雜性膽石癥發(fā)生的相關(guān)因素

3 討論

有報道指出，miR-29a可通過外源性凋亡途徑減輕膽管結(jié)扎后膽汁淤積性肝損傷和肝纖維化[11]；且miR-29a與機體血糖穩(wěn)定密切相關(guān)，可參與機體葡萄糖的攝取，維持機體葡萄糖平衡，并對胰島素分泌及抵抗過程起到調(diào)節(jié)作用[12]。Wu等[13]發(fā)現(xiàn)miR-29a與2型糖尿病患者的血清TC、載脂蛋白A1水平呈正相關(guān)，可直接反映糖脂代謝紊亂的程度，其原因可能與miR-29a具有穩(wěn)定血糖的功能，可抑制脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖，致使脂質(zhì)代謝物在體內(nèi)積聚有關(guān)。膽石癥的發(fā)生、發(fā)展與機體糖脂代謝紊亂密切相關(guān)，當TC呈過飽和狀態(tài)時，易析出結(jié)晶而形成結(jié)石；而miR-29a可誘導膽汁淤積，導致膽石癥發(fā)生。本文進一步對miR-29a與膽石癥嚴重程度的關(guān)系展開研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，膽石癥組患者血清miR-29a相對表達量高于對照組，表明miR-29a可能參與了膽石癥的發(fā)生過程。此外，研究結(jié)果進一步指出，復雜性膽石癥患者血清miR-29a相對表達量高于單純性膽石癥患者，表明miR-29a可能與膽石癥的發(fā)展存在聯(lián)系，提示檢測血清miR-29a有助于判斷膽石癥的嚴重程度。本研究構(gòu)建了miR-29a評估復雜性膽石癥的ROC曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-29a評估復雜性膽石癥的AUC高于0.8，表明miR-29a判斷膽石癥嚴重程度的效能較好。為明確miR-29a與復雜性膽石癥的關(guān)系，本研究采用多因素Logistic回歸分析復雜性膽石癥的影響因素，結(jié)果顯示肝硬化、腹腔積液、TC、miR-29a與復雜性膽石癥的發(fā)生密切相關(guān)，其原因可能為肝硬化患者的胃腸激素如膽囊收縮素水平下降，膽囊收縮運動受到抑制，導致膽石癥的發(fā)生、發(fā)展[14]；膽囊長期浸泡于腹腔積液中，易造成膽囊壁加厚，甚至發(fā)生纖維化，導致膽囊收縮力下降，膽汁淤積形成結(jié)石[15]；TC代謝障礙可導致TC在膽囊大量積聚，誘發(fā)膽結(jié)石的形成[16]。

有研究表明，膽汁淤積與膽石癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，而氧化應激反應與膽汁淤積密切相關(guān)[17-18]?；钚匝跏菂⑴c氧化應激反應的重要物質(zhì)，主要來源于線粒體。當膽汁淤積時，過多的膽紅素和膽汁酸積聚，引起肝細胞壞死及肝細胞膜脂質(zhì)過氧化，釋放大量的活性氧，激發(fā)氧化應激反應，進一步損傷肝細胞和毛細膽管細胞，引起膽管內(nèi)膽汁的分泌和排泄異常[19]。miR-29a可調(diào)節(jié)活性氧的表達水平，并可直接調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原蛋白α1的表達，從而減輕膽管結(jié)扎后膽汁淤積[20]。由此推測，miR-29a可能通過調(diào)節(jié)活性氧及膽汁淤積情況，參與膽石癥的疾病進展。

綜上所述，膽石癥患者血清miR-29a相對表達量明顯升高，其可能參與了膽石癥的疾病進展，檢測miR-29a表達水平有助于診斷復雜性膽石癥。本研究存在一定不足，比如未動態(tài)檢測膽石癥患者血清miR-29a相對表達量，且未明確miR-19a影響膽石癥病情進展的病理生理機制，下一步將進行基礎(chǔ)研究，對miR-29a影響膽石癥進展的病理生理機制進行探究。