3例新型冠狀病毒肺炎出院患者病毒核酸檢測復陽原因探討

秦維超，孫貴銀，李 峰，袁 進，張運洪，鄒靜波，陳 文

(重慶市江津區(qū)中心醫(yī)院：1.醫(yī)學檢驗科；2.院長辦公室；3.感染科，重慶 402260；4.重慶市永川區(qū)疾病預防控制中心，重慶 402160；5.重慶市江津區(qū)疾病預防控制中心，重慶 402260)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種急性感染性肺炎，是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起，可對公民生命健康造成嚴重危害的傳染性疾病[1-3]。采用實時熒光定量RT-PCR 檢測SARS-CoV-2核酸，開放讀碼框1ab(ORF1ab)和核衣殼蛋白N基因是主要的檢測靶點[4]。COVID-19患者咽拭子、痰、下呼吸道分泌物、外周血、糞便等標本可用于檢測SARS-CoV-2核酸[5]。其中，檢測出SARS-CoV-2核酸陽性是臨床確診COVID-19的依據(jù)，連續(xù)兩次病毒核酸檢測陰性是患者出院的標準之一[6]。病毒核酸檢測具有快速、早期、靈敏、特異等優(yōu)勢，但檢測結果的準確性還受到標本類型與質量、設備試劑性能、實驗操作以及不同疾病階段等因素影響[7]。

SARS-CoV-2核酸陽性是COVID-19病例確診的“金標準”[8]，而核酸檢測方法由于受采樣部位、采樣手法等多種因素的影響，也出現(xiàn)了一些假陰性的結果。隨著疫情的逐步控制，治愈出院患者也逐步增多，與此同時，也出現(xiàn)了出院患者復檢SARS-CoV-2核酸陽性的報道。LAN等[9]報道了武漢大學中南醫(yī)院COVID-19患者出院后核酸檢測復陽病例。重慶地區(qū)也出現(xiàn)了少數(shù)上述情況。本文回顧性分析了江津區(qū)中心醫(yī)院(以下簡稱“本院”)3例COVID-19患者在疾病初期確診、治療出院和轉診隔離過程中，3家醫(yī)療機構實驗室核酸檢測結果情況及診療轉歸流程，分析患者體內SARS-CoV-2排出時間，探討核酸檢測假陰性影響因素和疾病治療過程中SARS-CoV-2排出時間使出院患者核酸檢測結果復陽的可能原因。

1 病例資料

病例1，男，68歲。旅居史：2020年1月22日從湖北回重慶。發(fā)病： 1月31日，患者無明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱于本院就診。確診治療：2月4日江津區(qū)疾病預防控制中心(以下簡稱“疾控中心”)檢測咽拭子SARS-CoV-2核酸結果為陽性，診斷為COVID-19普通型；2月5日轉入重慶醫(yī)科大學附屬永川醫(yī)院(以下簡稱“定點醫(yī)院”)進一步隔離治療，采用干擾素a-2b注射液霧化，阿比朵爾、克力芝、中藥制劑抗病毒治療。出院：經(jīng)治療后患者連續(xù)11 d無發(fā)熱，2月15、16日連續(xù)兩次(間隔24 h)核酸檢測陰性，經(jīng)專家會診，符合出院患者標準出院。轉診隔離：2月17日出院后轉入本院隔離病區(qū)進行醫(yī)學隔離觀察、治療。復陽：2月18日，本院取患者咽拭子進行SARS-CoV-2核酸檢測，結果為陽性，19日咽拭子病毒核酸復檢再次陽性。給予阿比朵爾、左氧氟沙星、連花清瘟治療。第2次出院：2月21、23、25、29日取咽拭子檢測SARS-CoV-2核酸結果為陰性，經(jīng)專家組討論后予以出院。

病例2，男，56歲。接觸史：2020年1月16日與武漢相關人員接觸。發(fā)?。?月27日發(fā)熱(最高38.3 ℃)，于本院就診。確診治療：1月29日疾控中心檢測咽拭子SARS-CoV-2核酸陽性，結合臨床CT影像，診斷為COVID-19；1月30日轉入定點醫(yī)院住院治療。出院：經(jīng)抗病毒治療后連續(xù)5 d無發(fā)熱，2月4、5日連續(xù)2次咽拭子病毒核酸檢測(間隔24 h以上)結果陰性，專家會診后，符合出院標準出院。轉診隔離：2月7日轉入本院隔離病區(qū)進行醫(yī)學隔離觀察。復陽：2月8日咽拭子核酸檢測結果為陽性，2月15、16日再次采集咽拭子，結果均為陽性。予以連花清瘟抗病毒等治療。第2次出院：分別于2月19、21、23、25日取鼻咽拭子行SARS-CoV-2核酸檢測結果為陰性，經(jīng)專家組討論后予以出院。

病例3：男，37歲。旅居史：2020年1月12日從武漢回重慶。發(fā)?。?月16日，患者不明原因出現(xiàn)發(fā)熱、惡心、腹瀉，1月21日于本院就診。確診治療：1月24日疾控中心取鼻咽拭子核酸檢測陽性，診斷為COVID-19。1月27日轉入定點醫(yī)院進一步治療。出院：經(jīng)干擾素霧化、洛匹那韋利托那韋片等抗病毒治療，2月12、13日兩次核酸檢測呈陰性，經(jīng)專家會診后，符合出院標準出院。轉診隔離：2月14日轉入本院隔離病區(qū)繼續(xù)進行醫(yī)學觀察隔離治療。復陽：2月16日，本院采集鼻咽拭子核酸檢測為陽性，17日再次采樣核酸檢測結果均為陽性。本院予以連花清瘟抗病毒等治療。第2次出院：分別于2月19、21、23、25日取咽拭子行SARS-CoV-2核酸檢測結果為陰性。經(jīng)專家組討論后予以出院。

2 實驗室病毒核酸檢測情況分析

3例COVID-19患者在診療過程中進行了多次核酸檢測，分別選取碩世生物科技股份有限公司(以下簡稱“碩世”)SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(雙重熒光 PCR法，批號20200108)，中山大學達安基因股份有限公司(以下簡稱“達安”) SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(熒光PCR法，批號2020003)和湖南圣湘生物科技有限公司(以下簡稱“圣湘”)SARS-CoV-2核酸快速檢測試劑盒(PCR熒光探針法，批號2020003)，見表1。

表1 患者在確診、治療出院和出院后隔離過程中SARS-CoV-2核酸檢測試劑基本情況和技術指標

從核酸檢測結果分析可以看出，3例患者在疾控中心確診時核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值均較低，雙基因陽性明顯；出院時兩次核酸檢測陰性；出院后在本院隔離觀察時檢測核酸ORF1ab和N基因的Ct值均較高，結果呈雙基因弱陽性。病例1、2、3的ORF1ab單基因Ct值達39.81、40.26和41.12，病例2、3的ORF1ab基因Ct值大于相應核酸提取試劑的臨界Ct值40，但是分析熒光擴增曲線有明顯的尾部抬高，說明標本細胞病毒載量已經(jīng)很低，呈弱陽性檢測結果，見表2。

表2 患者在不同時間不同核酸檢測機構的核酸檢測情況(Ct值)

3 討 論

本文通過回顧性分析本院3例COVID-19患者在疾病初期確診、治療出院和轉診隔離過程中，分別對3家醫(yī)療機構實驗室核酸檢測結果情況及診療轉歸流程進行分析，以下將探討核酸檢測假陰性影響因素和疾病治療過程中SARS-CoV-2排毒時間使出院患者核酸檢測結果復陽的可能原因。

3.1采集標本病毒載量低 采集標本時要符合以下兩個標準：(1)要采集到含病毒的細胞標本；(2)被感染者的細胞中有達到檢測限的病毒載量。如果標本采集不規(guī)范，不能滿足以上兩個條件，將導致核酸檢測假陰性，可能造成出院患者核酸復陽情況發(fā)生。

當機體被病毒感染后，病毒首先通過鼻腔和口腔進入到咽喉部，再到氣管和支氣管，進而到達肺泡，不同病程階段以及機體不同部位存在的病毒載量有所不同，是因為這些部位細胞所含病毒受體占比不同，所以不同時間范圍和不同的采樣部位可能意味著不同的核酸含量[10]。發(fā)病初期采集標本時，病毒載量大的患者“取一次就陽性一次”。對于治療康復期的患者，其體內的病毒載量處于臨界點，采集到含有一定病毒載量的細胞標本比較困難。

文中3例患者核酸檢測結果分析顯示，疾病發(fā)病初期確診階段，病毒載量大，病毒標本采集比較容易，故病毒核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值均較低，呈雙基因陽性；在疾病治療隔離期，標本中病毒載量低，檢測核酸ORF1ab和N基因的Ct值均較高，其中病例1、2、3的核酸ORF1ab基因Ct值達39.81、40.26和41.12，表明出院后患者的病毒核酸檢測呈弱陽性，病毒載量低。如果患者在出院時標本采集不規(guī)范，并未采集到含有一定病毒載量的細胞，導致核酸檢測假陰性。因此，出院病例核酸復陽的原因極大可能因為標本采集不合格，而造成患者病毒核酸檢測結果呈假陰性。

本院對出院隔離患者進行了多次核酸檢測，發(fā)現(xiàn)采集到深部咽拭子時能發(fā)現(xiàn)肉眼可見的帶血標本，細胞量大，利于提高陽性率；并且本院實行多部位采集、多樣本混合檢測，一次性采集2份鼻咽拭子和2份口咽拭子標本，也利于提高陽性率。

同時，加強培訓，優(yōu)化和規(guī)范標本采集方法，可提高核酸檢測陽性率。疾病初期采集鼻咽拭子等上呼吸道標本，治愈康復期最好采集深部咳痰或者肺泡灌洗液等下呼吸道標本；規(guī)范采集的操作方法，掌握刮取標本位置、停留時間和力度等采集技巧也有利于提高陽性率。

3.2核酸檢測試劑靈敏度低 核酸檢測體外診斷試劑的可靠性非常重要，檢測的病毒核酸區(qū)域的選擇極為關鍵。為了提高檢測的靈敏度，多數(shù)廠家選擇病毒核酸序列中兩個或兩個以上的區(qū)域進行檢測。但是每種試劑都有檢測靈敏度的下限，因此，對患者進行咽拭子采樣時，病毒載量達不到檢測下限的時候，結果可能會呈現(xiàn)假陰性。郭元元等[11]也對6種國產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒的檢測性能進行了比較與分析，其結果顯示，呈弱陽性結果的患者標本可能不易檢出，各試劑的結果存在一定的差異。

從本院3例患者核酸檢測結果分析可見，疾病發(fā)病初期確診時體內病毒含量高，檢測病毒核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值均較低，核酸試劑陽性檢出率高；而在患者出院后康復過程中，患者病毒量低，檢測核酸ORF1ab和N基因的Ct值均較高，呈弱陽性。病例1、2、3的核酸ORF1ab基因Ct值達39.81、40.26和41.12，其病毒核酸ORF1ab基因Ct值達接近或者大于了核酸提取試劑所要求的臨界結果判斷值40，但是熒光擴增曲線有明顯的尾部抬高，呈弱陽性檢測結果。此外，本院在對3例患者隔離期弱陽性標本進行多種核酸檢測試劑比對試驗中發(fā)現(xiàn)，存在一定比例標本單個靶區(qū)域陽性的結果，說明試劑對標本不同區(qū)域的靈敏度確實存在差異，尤其在對弱陽性標本檢測時，不同試劑的不同單基因陽性結果表現(xiàn)更為明顯。因此，如果核酸檢測試劑的靈敏度較低將會造成患者弱陽性標本的核酸檢測結果呈假陰性。

3例患者在確診、治療、隔離觀察3個階段進行了多次核酸檢測，均采用了不同的核酸提取試劑和核酸檢測試劑。由于試劑廠家研發(fā)時間短，各種試劑靈敏度不同，為200～1 000 copy/mL；在疫情特殊時期，也沒有使用已知臨床標本進行必要的性能確認，當標本中病毒載量低于檢測下限時，靈敏度低的核酸檢測試劑就無法檢出病毒。沈利華等[12]對3種國產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測試劑進行臨床效能評估發(fā)現(xiàn)，不同核酸檢測試劑和核酸提取方法的陽性符合率和一致性均有較大的差異。

3.3病毒核酸檢測結果復陽與疾病病程發(fā)展和臨床治療用藥具有一定關系 SARS-CoV-2感染機體后，兩周內產(chǎn)生抗體，因此，傳播風險較低，這種抗體對人體有保護作用，對病毒的清除也會持續(xù)進行。ZHOU等[13]研究了SARS-CoV-2的排毒時間，指出137例出院患者的中位排毒時間為20 d，最短8 d，最長可達37 d。肺炎是潛伏期較長的疾病，部分COVID-19復陽病例是處于炎癥在吸收過程中，不是臨床的痊愈，因此，可能存在產(chǎn)生間歇性排毒現(xiàn)象，但需要大樣本量、多中心研究進行進一步的證實。

3例患者均使用了抗病毒藥物等治療，從患者臨床表現(xiàn)和影像CT結果看，清除病毒治療有效，兩次核酸檢測陰性后，從定點醫(yī)院出院，符合診療規(guī)范。病例1、2、3從出院到核酸檢測結果復陽時間為2～7 d，其中病例1、2、3從確診病毒核酸檢測結果陽性到隔離觀察時病毒核酸檢測結果為陰性的時間分別是第18、22、27天，表明SARS-CoV-2在患者體內存留時間不同，提示患者排毒時間可能與疾病病程發(fā)展有關，并且通過對病毒核酸ORF1ab和N基因熒光通道Ct值比較發(fā)現(xiàn)，隨著治療時間延長，體內排毒量可能逐漸降低。因此COVID-19患者治療后期病毒排毒量和排毒時間的不確定，是否為患者核酸復陽的原因均需有待進一步研究證實。

本院對3例患者在隔離期檢測核酸復陽后連續(xù)監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)，病例1、2、3在最后一次核酸陽性2 d之后再行多次核酸檢測均為陰性。表明體內病毒在逐漸清除可以達到完全康復。

綜上所述，COVID-19的診斷和治療是一個綜合臨床思辨的過程，要充分認識到SARS-CoV-2核酸檢測的影響因素較多，反復多次的核酸檢測具有一定必要性，同時重視提高檢測試劑的靈敏度，加強質量控制和規(guī)范標本的采集，從而提高診斷的陽性率。COVID-19治療出院患者SARS-CoV-2核酸檢測結果復陽時，一種情況是疾病沒有完全治愈，臨床癥狀緩解，但是體內還存在少量的病毒，可能因為標本采集不規(guī)范和各種試劑盒核酸檢測靈敏度不同，造成了患者體內核酸檢測結果呈假陰性，導致COVID-19治療出院后的核酸檢測結果復陽；另一方面可能是患者體內SARS-CoV-2排毒時間不規(guī)律和不確定導致出院后病毒核酸檢測結果復陽，還有待進一步證實。為了防止出院后患者核酸檢測結果復陽，相關機構需要制訂更加嚴格的出院標準，可以增加SARS-CoV-2核酸檢測的次數(shù)，同時，增加對SARS-CoV-2特異性抗原、抗體檢測[14]，綜合判斷COVID-19患者診斷標準和出院標準，減少感染風險。