IgA 腎病患者與膜性腎病患者外周血單核細(xì)胞mRNA分析

梁 爽，凡 奎，張 燕，謝楊眉

(四川省三臺縣人民醫(yī)院 腎內(nèi)科，四川 綿陽 621100)

IgA腎病(IgA Nephropathy，IgAN)是最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，20%～40%的患者在20年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎病[1]。膜性腎病(Membranous Nephropathy,MN)是腎病綜合征常見的病理類型之一。經(jīng)腎臟活檢可確切診斷和鑒別IgAN和MN，但腎穿為有創(chuàng)檢查，存在不易操作等因素。因此，了解 IgAN 和MN的疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及尋找特異性生物標(biāo)記物，能為診斷和鑒別提供簡便、可靠的依據(jù)補(bǔ)充。

運用傳統(tǒng)的研究方法和數(shù)據(jù)處理分析方式常遇見高維度、小樣本、變異大、線性等問題, 不易做到簡便的分類和有效的、系統(tǒng)的分析。生物信息學(xué)技術(shù)通過綜合利用生物學(xué)、計算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)等多學(xué)科技術(shù)、手段，能夠精確高效的運算大量、復(fù)雜的生物數(shù)據(jù)。通過下載IgAN和MN患者外周血單核細(xì)胞DNA高通量數(shù)據(jù)集，分析篩選關(guān)鍵基因和途徑，進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)功能、京都基因基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome，KEGG)和顯著富集基因蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)分析等進(jìn)一步了解差異表達(dá)基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。

1 材料與方法

1.1 GEO數(shù)據(jù)庫芯片數(shù)據(jù)下載

進(jìn) 入NCBI Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，下載GSE73953數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含 15個IgAN樣本和8個MN樣本。下載其矩陣文件 SOFT formatted family file(s).SOFT 以及原始數(shù)據(jù) GSE73953_RAW.tar。通過GEO數(shù)據(jù)庫評價數(shù)據(jù)原始值分布。

1.2 方法

1.2.1 篩選差異表達(dá)基因(DEGs)

R是集統(tǒng)計分析與圖形顯示于一體的一種統(tǒng)計分析軟件。它擁有一套完整的數(shù)據(jù)處理、計算和制圖軟件系統(tǒng)。其主要功能包括：數(shù)據(jù)存儲、數(shù)組運算、統(tǒng)計分析、統(tǒng)計作圖和程序編寫等。

下載安裝R軟件。加載limma包[2]，對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和處理，以及差異表達(dá)基因的分析(|LogFC|>2,P<0.05)。R軟件采用R/Bioconductor software version 3.5.1版本。

1.2.2 差異表達(dá)基因GO和KEGG分析

運用Cytoscape(https://cytoscape.org/),安裝bingo，將篩選出的前96個差異表達(dá)基因?qū)氤绦?，根?jù)GEO中數(shù)據(jù)研究對象，選擇Homo sapiens。

運用DAVID數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/)對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。Corrected P-Value<0.05 記為有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 顯著富集差異表達(dá)基因PPI分析

STRING(Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes，https://string-db.org/)是已知和預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫。相互作用包括直接(物理)聯(lián)系和間接(功能)聯(lián)系。它們來源于計算預(yù)測、生物體之間的知識轉(zhuǎn)移以及來自其他(主要)數(shù)據(jù)庫的相互作用。

運用STRING在線數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，取combined score≥0.4，下載PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。通過Cytoscape軟件(version 3.6.1)將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化，并通過MCODE插件聚類構(gòu)建共表達(dá)模塊。最后，通過R軟件計算PPI 網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的連接度。運行后得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖。

2 結(jié)果分析

2.1 GEO數(shù)據(jù)庫芯片數(shù)據(jù)

數(shù)據(jù)來自GEO數(shù)據(jù)庫GSE73953數(shù)據(jù)集，下載得到15個IgA Nephropathy樣本和8個Membranous Nephropathy樣本。得到矩陣文件SOFT formatted family file(s).SOFT 以及原始數(shù)據(jù) GSE73953_RAW.tar。通過GEO數(shù)據(jù)庫GEO2R評價數(shù)據(jù)集原始值分布(見圖1)，基本以中間值為中心表明數(shù)據(jù)具有可比較性。

2.2 差異表達(dá)基因(DEGs)

該數(shù)據(jù)集包含15個IgA Nephropathy樣本和8個Membranous Nephropathy樣本。通過R軟件limma包[2]，根據(jù)限定條件：|LogFC|>2,P<0.05，在IgAN患者和MN患者中得到顯著差異表達(dá)基因75個，其中73個上調(diào)表達(dá)基因和2個下調(diào)表達(dá)基因。由差異表達(dá)基因所得熱圖(見圖2a)和火山圖(見圖2b)。

2.3 差異基因GO和KEGG分析

為進(jìn)一步了解篩選得到IgAN、MN疾病相關(guān)的差異表達(dá)基因功能和通路，利用 Cytoscape和DAVID在線數(shù)據(jù)庫對分析得到的差異基因分別進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路分析。

顯著富集差異表達(dá)基因GO富集分析的生物學(xué)過程(Biological process，BP)(見圖3a)主要包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、內(nèi)溶酶體到溶酶體轉(zhuǎn)運、趨化因子介導(dǎo)的信號通路作用和鈣介導(dǎo)信號的調(diào)控等。細(xì)胞學(xué)組分(Cellular components，CC)(見圖3b)主要為COPⅡ囊泡、NMDA選擇性谷氨酸受體復(fù)合物和高爾基體等。分子生物學(xué)功能(Molecular function，MF)(見圖3c)主要有NMDA谷氨酸受體激活、信號傳感器激活和鈣粘蛋白結(jié)合參與細(xì)胞與細(xì)胞的黏附等。

顯著富集差異表達(dá)基因KEGG通路分析(見圖3d)顯示具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)的上調(diào)及下調(diào)差異表達(dá)基因通路，包括Endocytosis和Hepatitis B的相關(guān)信號通路。

圖1 原始數(shù)據(jù)集值分布Fig.1 Values distribution of original data set

圖2 差異表達(dá)基因熱圖和火山圖Fig.2 Heatmap and volcano map of the DEGs

圖3 GO富集分析和KEGG通路分析Fig.3 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis

2.4 顯著富集基因PPI分析

為進(jìn)一步篩選差異表達(dá)基因所編碼的蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，采用STRING工具對差異表達(dá)基因蛋白相互作用關(guān)系進(jìn)行梳理，得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系圖(見圖4)。按照節(jié)點數(shù)關(guān)系篩選得到前10個關(guān)鍵基因，包括：EPS15、STAT4、CCL2、SUN2、SEC24C、SEC31A、GOLGB1、F2R,RAB12和PTK2B。

圖4 顯著富集差異表達(dá)基因蛋白相互作用關(guān)系Fig.4 Protein interaction of significantly enriched DEGs

3 討 論

IgAN目前被認(rèn)為是世界上最常見的原發(fā)性腎小球腎炎之一[1]。MN是腎病綜合征常見的病理類型之一，大部分為特發(fā)性膜性腎病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)[3]。MN的主要病理機(jī)制為：循環(huán)的自體抗體與腎小球內(nèi)的內(nèi)源性抗原結(jié)合，并在腎小球毛細(xì)血管壁中形成免疫復(fù)合物的沉積，補(bǔ)體激活對腎小球足細(xì)胞(Podocytes)的影響和對細(xì)胞屏障的破壞，導(dǎo)致NS表現(xiàn)[4]。

探尋IgAN 和MN的疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及尋找特異性生物標(biāo)記物，以便診斷和鑒別甚至發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)通過利用生物學(xué)、計算機(jī)學(xué)和信息技術(shù)揭示生物數(shù)據(jù)所蘊含的奧秘[5]。為了尋找可能有助于更好地理解IgAN和MN分子基礎(chǔ)并有助于診斷的活性病變的新標(biāo)記物，使用外周血單核細(xì)胞(PBMCs)進(jìn)行DNA分析。通過下載IgAN和MN患者外周血單核細(xì)胞DNA高通量數(shù)據(jù)集，通過篩選差異表達(dá)基因、基因富集分析及蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系分析。

分析發(fā)現(xiàn)，在具有明顯表達(dá)差異的250個基因中，包括226個上調(diào)的差異表達(dá)基因和24個下調(diào)的差異表達(dá)基因。其中75個顯著DEGs，包括73個上調(diào)基因，2個下調(diào)基因。GO富集分析的生物學(xué)過程(BP)主要包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、內(nèi)溶酶體到溶酶體轉(zhuǎn)運、趨化因子介導(dǎo)的信號通路作用等。細(xì)胞學(xué)組分(CC)主要為COPⅡ囊泡、NMDA選擇性谷氨酸受體復(fù)合物和高爾基體等。分子生物學(xué)功能(MF)主要有NMDA谷氨酸受體激活、信號傳感器激活和鈣粘蛋白結(jié)合參與細(xì)胞與細(xì)胞的黏附等。顯著富集差異表達(dá)基因KEGG通路分析包括Endocytosis和Hepatitis B的相關(guān)信號通路。PPI篩選出EPS15、STAT4、CCL2、SUN2、SEC24C、SEC31A、GOLGB1、F2R,RAB12和PTK2B等關(guān)鍵基因。

EPS15為表皮生長因子受體底物基因，參與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)[6]?？赡軈⑴c細(xì)胞增殖的控制，有絲分裂信號的調(diào)節(jié)，特別是EGFR在網(wǎng)格蛋白涂層凹坑(CCPs)的組裝中發(fā)揮作用，可能參與IgA介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[7]。STAT4是一種轉(zhuǎn)錄因子，它在T細(xì)胞和單核細(xì)胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)IL-12和IL-23的生成，導(dǎo)致單核細(xì)胞激活[8]，一些證據(jù)顯示，STAT4可能在多種自身免疫性疾病的進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[9]。相關(guān)研究利用炎癥相mRNA表達(dá)譜顯示，IgAN患者體內(nèi)外體趨化因子(C-C motif)配體2 (CCL2)表達(dá)上調(diào)[10]，表明CCL2可能參與IgA腎臟病的發(fā)病和進(jìn)展。細(xì)胞學(xué)組分(CC)分析發(fā)現(xiàn)主要存在COPⅡ囊泡和高爾基體的差異，研究顯示在prechylomicron運輸囊泡(PCTV)與高爾基體對接時，存在COPII蛋白，并且是需要SEC24C參與[11]。F2R基因存在功能多態(tài)性，研究顯示其啟動子多態(tài)性改變在結(jié)節(jié)病中的作用，主要導(dǎo)致炎癥的加重[12],IgAN和MN存在炎性改變，F(xiàn)2R對其是否存在具體影響，目前尚無確切研究證據(jù)。RAB12在人PMBCs磷酸化中起重要作用，在帕金森疾病表現(xiàn)顯著[13]，而同SUN2、SEC31,GOLGB1和PTK2B在人IgAN和MN中的具體作用和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論與展望

篩選出核心差異表達(dá)基因,特別是EPS15、STAT4、CCL2,SEC24C和F2R，為IgAN和MN的診斷和鑒別提供簡便、可靠的依據(jù)補(bǔ)充，甚至提供治療的新靶點。研究和掌握IgAN和MN疾病特異性的發(fā)病機(jī)制和特異性標(biāo)記物，對現(xiàn)階段IgAN和MN的診斷和鑒別具有重要意義。探討基因表達(dá)及調(diào)控，挖掘特異性蛋白質(zhì)表達(dá)和PPI，有助于尋找新治療靶點。