一種新型硫化氫近紅外比率熒光探針的研制

韓志湘， 顧宇形， 王 洋， 董良?xì)g， 姜 舒

(江蘇大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

眾所周知，硫化氫是一種無色的具有臭雞蛋氣味的有毒氣體[1].然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫是人體內(nèi)3種主要的氣體信號物質(zhì)之一[2]，參與人體內(nèi)許多生理和病理過程[3]，如調(diào)節(jié)正常肝臟以及病變肝臟中的微血管循環(huán)、心肌收縮力調(diào)節(jié)、血管舒張、血壓雙向平穩(wěn)調(diào)節(jié)等[4-6].同時(shí)，硫化氫能有效去除過氧化氫、超氧陰離子、次氯酸等，在人體內(nèi)還具有抗氧化應(yīng)激和抗炎反應(yīng)等重要作用.因此，在活細(xì)胞、組織甚至活體中檢測硫化氫對于了解其在生物體中的作用是非常重要的.

目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)出多種檢測硫化氫的分析方法，如電化學(xué)方法、氣相色譜法、比色法等[7-9]，但這些方法由于檢測所需時(shí)間長、制備復(fù)雜、會對組織和細(xì)胞造成破壞等缺陷而不適合檢測生物系統(tǒng)中的硫化氫.而熒光分析法由于具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、檢測速度快、操作簡便、對生物樣品無損傷等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域.目前為止，已有許多用于檢測硫化氫的熒光探針被開發(fā)出來.但許多探針仍然存在一些問題，如響應(yīng)時(shí)間長、靈敏度不夠高、易受細(xì)胞內(nèi)脂肪酶干擾等.而激發(fā)或發(fā)射波長在近紅外區(qū)域(>650 nm)的熒光探針可以消除生物體自發(fā)熒光的干擾，同時(shí)在生物體內(nèi)具有更深的組織穿透性和更少的樣品損傷，因此在生物樣品分析和生物體內(nèi)成像方面具有明顯優(yōu)勢[10-12].另一方面，比率型熒光探針具有雙波長發(fā)射(或激發(fā))的特點(diǎn)，因此可使用2個(gè)不同的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量檢測，可以消除探針濃度、光漂白、檢測設(shè)備等因素所造成的數(shù)據(jù)失真.因此，研制一種響應(yīng)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的近紅外比率熒光探針具有重要的科學(xué)意義.

花色素染料具有優(yōu)異的光物理性能、良好的生物兼容性、較高的熒光量子產(chǎn)率和結(jié)構(gòu)易調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于熒光探針的構(gòu)建.文中擬研制一種含有半剛性環(huán)己基的花色素染料近紅外比率熒光探針1，以期完成響應(yīng)速度快、選擇性強(qiáng)、靈敏度高且可用于活細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性和外源性的硫化氫檢測.

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

無水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)是先用無水硫酸鎂干燥24 h，過濾后油泵減壓蒸餾后得到，再加入活化的4?分子篩后保存?zhèn)溆?其他試驗(yàn)中所用到的化學(xué)試劑均為市售分析純試劑，不經(jīng)純化直接使用.整個(gè)試驗(yàn)過程均使用二次蒸餾水.柱層析所用硅膠(100～200目)購自青島海洋化工廠.

核磁共振譜圖在Varian INOVA 400核磁共振儀上獲得；液相質(zhì)譜分析是在LXQ Spectrometer (Thermo Scientific, USA)上得到的；所有的熒光分析試驗(yàn)均在Thermo Scientific Lumina熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行；紫外吸收光譜試驗(yàn)在Shimadzu UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)上進(jìn)行；溶液pH值用瑞士Mettler Toledo Five Easy Plus FE28型精密pH計(jì)測定.細(xì)胞成像在Carl Zeiss公司Axio Observer A1倒置熒光顯微鏡上測定.肝癌細(xì)胞(human hepatoma G2，HepG2)通過含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng).

1.2 探針分子1的合成

圖1給出了化合物1的合成路線.

圖1 化合物1的合成路線

如圖1所示，將化合物2(142 mg，0.5 mmol)和4-(二乙氨基)水楊醛(92 mg，0.5 mmol)溶于濃硫酸中(5 mL).混合物在90 ℃攪拌4.5 h，冷卻至室溫后，向溶液中加入冰(5 g)和70%高氯酸(0.25 mL)，過濾，用水洗滌，得到粗產(chǎn)物.粗產(chǎn)物再通過硅膠柱層析(體積比V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=30 ∶1～20 ∶1)得到黑色探針固體化合物1(216 mg，80%).

1.3 測量過程

將適量的探針分子1溶于色譜純乙腈中得到10-3mol·L-1的探針儲備液.稱取適量的硫氫化鈉固體，用蒸餾水溶解定容至100 mL，得到10-3mol·L-1的硫化氫標(biāo)準(zhǔn)溶液.上述溶液均在4 ℃條件下避光保存.所有光譜測試均在PBS緩沖溶液(體積比V(乙腈) ∶V(PBS)=3 ∶7，pH=7.4)中進(jìn)行.向一定體積的PBS-乙腈緩沖溶液中加入20 μL的探針1和一定體積的硫化氫的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到2.0 mL的待測溶液.此時(shí)測試體系中探針1的最終濃度為10 μmol·L-1，硫化氫濃度為0.1～6.0 μmol·L-1.

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜性質(zhì)

圖2是探針1(10 μmol·L-1)與不同濃度硫化氫的紫外吸收光譜圖.

圖2 探針分子1與不同濃度NaHS反應(yīng)前后的紫外-可見光譜

由圖2可見，探針分子1的最大吸收峰在674 nm處.隨著硫化氫濃度的增加，674 nm處的吸收強(qiáng)度逐漸降低，同時(shí)在437 nm處出現(xiàn)新的吸收峰.這表明探針1與硫化氫反應(yīng)后，其自身濃度逐漸降低而生成的新產(chǎn)物濃度逐漸增加.圖3為探針1(10 μmol·L-1)與不同濃度的NaHS結(jié)合后的熒光光譜圖.

圖3 與NaHS反應(yīng)后探針分子1溶液的熒光光譜圖

由圖3可見,當(dāng)溶液中僅存在探針分子時(shí)，熒光強(qiáng)度在503 nm(λex=450 nm)處最低，而在720 nm(λex=630 nm)處顯示最強(qiáng).隨著加入的硫化氫濃度增加，探針1在503 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增加，而在720 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減小，呈現(xiàn)典型的比率發(fā)射模式.當(dāng)加入4 μmol·L-1的硫化氫后，體系熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，表明二者已經(jīng)反應(yīng)完全；此時(shí)熒光強(qiáng)度較探針本身增強(qiáng)了19.2倍.圖4是探針1在503，720 nm處的熒光強(qiáng)度比值(F503/F720)與硫化氫濃度線性關(guān)系圖.

圖4 NaHS濃度與探針分子1溶液熒光強(qiáng)度的關(guān)系圖

由圖4可見，探針分子1對硫化氫響應(yīng)的線性濃度范圍為0.1～4.0 μmol·L-1(R2=0.993 9).設(shè)I為503 nm處的熒光強(qiáng)度，根據(jù)滴定試驗(yàn)結(jié)果，以探針1的(Imin-I)/(Imin-Imax)對硫化氫濃度的對數(shù)作圖(見圖5)，可以得到探針1對硫化氫的檢測下限為57.8 nmol·L-1，遠(yuǎn)低于大多數(shù)報(bào)道的硫化氫比率型熒光探針.

圖5 探針1的(Imin-I)/(Imin-Imax)與NaHS濃度的關(guān)系曲線圖

2.2 pH影響

為了探究探針1是否可以在生理pH范圍內(nèi)對硫化氫進(jìn)行檢測，考察了不同pH下探針1的檢測性能，結(jié)果見圖6.

如圖6所示，探針分子本身在pH為6.5～9.5的范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，表明探針1在寬pH范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，探針分子本身的結(jié)構(gòu)不會因?yàn)槿芤簆H環(huán)境的變化而改變.而探針分子1在503，720 nm處的2個(gè)發(fā)射信號熒光強(qiáng)度比值F503/F720在加入硫化氫前后有顯著變化.當(dāng)硫化氫加入后，pH在6.5～7.0時(shí)，溶液體系的熒光強(qiáng)度稍微增強(qiáng)；當(dāng)pH處于7.5～8.5時(shí)，體系熒光強(qiáng)度比值波動最明顯；pH在9.0～9.5時(shí)，熒光強(qiáng)度又略微下降.考慮到其實(shí)際應(yīng)用，選取pH=7.4的生理?xiàng)l件為測試條件.

2.3 選擇性

接下來考察了一些常見的各種無機(jī)離子、活性氧和生物硫醇等對探針分子1熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果見圖7.

圖7 探針分子1對NaHS識別的選擇性

2.4 響應(yīng)時(shí)間

進(jìn)一步研究了探針分子1識別硫化氫的響應(yīng)時(shí)間，結(jié)果見圖8.

圖8 探針分子1與NaHS的時(shí)間響應(yīng)曲線

如圖8所示，加入6 μmol·L-1硫化氫后可以觀察到熒光強(qiáng)度顯著增加，并且在110 s時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值并趨于平穩(wěn)，這表明探針分子在110 s內(nèi)就可以與硫化氫完全反應(yīng)，響應(yīng)速度很快，這對于檢測活細(xì)胞中的硫化氫是非常有益的.

2.5 細(xì)胞試驗(yàn)

鑒于探針1具有響應(yīng)速度快、選擇性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，將其用于HepG2細(xì)胞中硫化氫的熒光成像檢測，結(jié)果見圖9.

如圖9所示，僅用探針1(10 μmol·L-1)孵育的HepG2細(xì)胞在綠色通道中顯示可忽略的熒光，但在紅色通道中顯示強(qiáng)熒光(圖9e-h).然后再用200 μmol·L-1的硫化氫在37 ℃處理細(xì)胞30 min后(圖9i-l)，可以觀察到紅色通道中的熒光減少，而綠色通道中的熒光增加.為了驗(yàn)證熒光反應(yīng)是由外源性硫化氫引起的，將HepG2細(xì)胞與200 μmol·L-1的N-甲基馬來酰亞胺(NMM)預(yù)孵育30 min，以降低細(xì)胞內(nèi)硫化氫水平，然后再加入探針1(10 μmol·L-1)在37 ℃孵育30 min.可以看到在抑制劑NMM的存在下，熒光響應(yīng)被顯著抑制(圖9a-d)，綠色通道中幾乎沒有熒光，而紅色通道中也只有微弱的熒光.接下來，文中還評估了探針1用于檢測內(nèi)源性硫化氫的潛在效用.L-半胱氨酸是一種可以刺激細(xì)胞內(nèi)硫化氫濃度的生物硫醇.因此先用300 μmol·L-1的L-半胱氨酸在37 ℃處理細(xì)胞30 min后，再用探針1(10 μmol·L-1)進(jìn)一步培養(yǎng)30 min，在綠色通道中觀察到明亮的熒光信號，而在紅色通道中觀察到很少的熒光信號.這意味著探針1還可以監(jiān)測復(fù)雜生物系統(tǒng)中的內(nèi)源性硫化氫.上述結(jié)果證明探針1可用于檢測HepG2細(xì)胞中的內(nèi)源性和外源性硫化氫.

圖9 探針分子1與內(nèi)/外源性硫化氫作用前后的成像圖

3 結(jié) 論

設(shè)計(jì)合成了一種基于花色素染料的新型近紅外比率熒光探針1.該探針不僅合成快速簡便、產(chǎn)率高，而且對硫化氫表現(xiàn)出比率響應(yīng)、寬濃度范圍識別、快速、高靈敏、高選擇性及可在生理?xiàng)l件下檢測等優(yōu)異的分析性能.同時(shí)該探針還成功應(yīng)用于HepG2活細(xì)胞中內(nèi)源性和外源性硫化氫的紅/綠雙色可視化熒光成像檢測.