丙泊酚對骨肉瘤細(xì)胞的影響及機(jī)制研究

張熙 王東偉 曾凡榮 劉爽 馬雷 于祥菊

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的骨惡性腫瘤，其特征是骨腫瘤細(xì)胞增殖產(chǎn)生類骨樣或未成熟骨基質(zhì)[1]。目前治療措施包括根治性保肢手術(shù)，術(shù)前新輔助化療，術(shù)后多藥聯(lián)合化療[2]。骨肉瘤的治療和檢查都需要采用外科手術(shù)，如活檢、病理切片和腫瘤切除等，而這些手術(shù)通常需要選用全身麻醉。研究表明，麻醉技術(shù)改變了分子環(huán)境可能會影響到癌細(xì)胞的功能，這可能是由于麻醉劑和阿片類藥物對疼痛的影響所導(dǎo)致[3]。據(jù)報道，麻醉會損傷人體免疫反應(yīng)，在手術(shù)刺激下使癌細(xì)胞更易擴(kuò)散到周圍組織和循環(huán)內(nèi)[4]。由此可見，癌細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移更易發(fā)生在外科手術(shù)期間。各種麻醉藥物用于癌癥切除手術(shù)中，然而許多麻醉藥物對腫瘤的影響仍不清楚。因此，研究麻醉藥物對腫瘤的影響對腫瘤治療，減少腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率尤為重要。丙泊酚是一種廣泛而常用的靜脈麻醉藥物。最近，越來越多的證據(jù)表明丙泊酚能夠在體內(nèi)和體外影響腫瘤細(xì)胞的增殖、擴(kuò)散和遷移[5，6]。因此，丙泊酚可能成為一種針對腫瘤手術(shù)較好的麻醉藥物[7]。然而，丙泊酚對骨肉瘤細(xì)胞的影響及其機(jī)制卻鮮有報道。本研究將探尋丙泊酚對人骨肉瘤細(xì)胞的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞購于北納創(chuàng)聯(lián)生物公司。U2OS細(xì)胞37℃快速復(fù)蘇后，于McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)重懸后，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)90%時，0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞傳至4～5代后用于后續(xù)實驗。

1.2 實驗分組及處理 用DMSO將丙泊酚稀釋配制成1 μg/μl的丙泊酚溶液。按隨機(jī)數(shù)字法，分為4組。D組：在4 ml McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中加入DMSO 4μl；P5組：將配制好的丙泊酚溶液20 μl 加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中(培養(yǎng)基中丙泊酚濃度為5 μg/ml)；P10組：將配制好的丙泊酚溶液40 μl加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中(培養(yǎng)基中丙泊酚濃度為10 μg/ml)；P20組：將配制好的丙泊酚溶液80 μl加入McCoy’s 5A培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中(培養(yǎng)基中丙泊酚濃度為20 μg/ml)。取對數(shù)生長期U2OS細(xì)胞按不同分組加入培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 人骨肉瘤U2OS細(xì)胞加入96孔板中，培養(yǎng)達(dá)到對數(shù)生長期時按不同分組加入各濃度丙泊酚，每組設(shè)3個復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、36 h后，棄去藥物，各孔加入100 μl 培養(yǎng)基和10 μl MTT試劑，設(shè)置調(diào)零孔：無細(xì)胞培養(yǎng)基+MTT；對照孔：含細(xì)胞培養(yǎng)基+MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度，公式：細(xì)胞抑制率(%)= [1-(試驗組吸光度-調(diào)零組吸光度)/(對照組吸光度-調(diào)零組吸光度)]×100% 計算細(xì)胞抑制率。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期人骨肉瘤U2OS細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板，5×105/孔培養(yǎng)24 h后，按分組加入不同濃度丙泊酚處理24 h后收集各組細(xì)胞，4℃ PBS洗滌2遍，重懸細(xì)胞至1×106/ml。取500 μl細(xì)胞懸液，分別加入Annexin-V FITC和PI染液各5 μl，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測，早期凋亡(FITC+，PI-)；晚期凋亡和死亡(FITC+，PI+)。

1.5 Western blotting檢測蛋白表達(dá) 收集各組處理24 h后細(xì)胞，PBS液洗3遍后13 000 r/min 離心15 min，棄上清。加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑(100∶1)，4℃靜置30 min，13 000 r/min 離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度，將樣品蛋白和5×樣品緩沖液以4∶1 混勻，100℃煮沸10 min，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(PVDF膜甲醇浸泡激活)，37℃封閉1 h，加一抗，4℃過夜。TBST洗膜5 min/3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次/5 min。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參。化學(xué)發(fā)光試劑ECL顯影，曝光。采用光密度掃描儀計算積分光密度，取與β-actin的比值反映蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 ROS檢測 取對數(shù)生長期人骨肉瘤U2OS細(xì)胞加入6孔培養(yǎng)板，5×105/孔培養(yǎng)24 h后，按分組加入不同濃度丙泊酚處理24 h后收集各組細(xì)胞待測，按1∶500的比例用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為20 μmol/L。將收集好的細(xì)胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞密度約1×106個。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育60 min。1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，PBS洗滌2遍，PBS重懸細(xì)胞。熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度，488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，測定結(jié)果以熒光強(qiáng)度/毫克蛋白表示。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對人骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響 不同濃度(5 μg/ml；10 μg/ml；20 μg/ml)分別作用于U2OS細(xì)胞12 h，24 h，36 h后，用MTT法檢測丙泊酚對細(xì)胞的增殖抑制率。結(jié)果顯示，D組生長抑制率分別為(40.8±0.5)%、(47.0±0.5)%、(47.2±0.4)%；P5組生長抑制率分別為(46.9±0.6)%、(61.5±0.4)%、(68.5±0.3)%；P10組生長抑制率分別為(61.2±0.2)%、(71.4±0.5)%、(79.1±0.2)%；P20組生長抑制率為(76.9±0.8)%、(80.7±0.2)%、(88.4±0.1)%。各組生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，F(xiàn)=581.625)。見圖1。

圖1 不同濃度丙泊酚對U2OS細(xì)胞生長抑制率曲線

2.2 丙泊酚對人骨肉瘤細(xì)胞凋亡的影響 為了進(jìn)一步檢測丙泊酚對人骨肉瘤細(xì)胞U2OS凋亡的影響，各組U2OS細(xì)胞經(jīng)丙泊酚處理24 h后，流式細(xì)胞儀檢測顯示，DMSO處理后U2OS細(xì)胞凋亡率僅為(1.6±0.5)%；5 μg/ml丙泊酚處理組U2OS細(xì)胞凋亡率為(11.8±2.4)%；10 μg/ml丙泊酚處理組U2OS細(xì)胞凋亡率為(23.3±4.8)%；20 μg/ml丙泊酚處理組U2OS細(xì)胞凋亡率為(33.8±3.3)%。4組間凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,F=53.386)?？梢婋S著丙泊酚濃度升高，U2OS細(xì)胞凋亡不斷增高，丙泊酚對U2OS細(xì)胞凋亡呈劑量濃度依賴性。見圖2。

圖2 不同濃度丙泊酚對U2OS細(xì)胞凋亡率的影響

2.3 丙泊酚對人骨肉瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為了進(jìn)一步確認(rèn)不同濃度丙泊酚對人骨肉瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，western blotting檢測了其不同組中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，隨著丙泊酚濃度的增加，凋亡通路的Cleaved Caspase-3及其下游Cleaved parp蛋白表達(dá)增高，P20組Caspase-3前體蛋白顯著減少；凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2降低。其與內(nèi)參蛋白光密度比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3，表1。

圖3 4組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表1 4組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.4 丙泊酚對人骨肉瘤細(xì)胞ROS水平的影響 ROS熒光檢測結(jié)果顯示，D組U2OS細(xì)胞中ROS表達(dá)濃度為121.00±3.61(熒光強(qiáng)度/毫克蛋白)；P5組U2OS細(xì)胞中ROS表達(dá)濃度為169.67±2.08(熒光強(qiáng)度/毫克蛋白)；P10組U2OS細(xì)胞中ROS表達(dá)濃度為287.67±2.52(熒光強(qiáng)度/毫克蛋白)；P20組U2OS細(xì)胞中ROS表達(dá)濃度為294.33±4.16(熒光強(qiáng)度/毫克蛋白)；ROS表達(dá)水平隨丙泊酚濃度增加而增加(P<0.001，F(xiàn)=2187.827)。見圖4。

圖4 不同濃度丙泊酚處理U2OS細(xì)胞后ROS表達(dá)水平

3 討論

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡的過程，通常發(fā)生在生長和衰老過程中，是維持生物組織中細(xì)胞群內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制[8]。凋亡的進(jìn)程由外在的死亡受體途徑以及內(nèi)在的線粒體介導(dǎo)凋亡通路啟動[9]，癌癥細(xì)胞的致癌作用和發(fā)病機(jī)理與這兩條凋亡通路的缺失有關(guān)[10]。細(xì)胞凋亡主要由半胱氨酸蛋白酶(Caspase)級聯(lián)和Bcl-2家族蛋白調(diào)控[11]。

Caspase是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種特殊蛋白質(zhì)，它的活化是細(xì)胞凋亡機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。其中Capase-3是凋亡通路下游的最關(guān)鍵執(zhí)行者，Caspase-3被切割后將其下游的PARP切割成羧基端的催化結(jié)構(gòu)域(89 kD)和氨基端的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(24 kD)，PARP失去其酶活性使細(xì)胞不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致DNA斷裂，參與凋亡途徑的最后階段。研究發(fā)現(xiàn)，藥物及射線等抗腫瘤治療通過Caspase依賴途徑導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞凋亡[12]。在臨床麻醉中，全身麻醉的靶向血漿丙泊酚濃度為 3～8 μg/ml[13]。本研究中隨著丙泊酚濃度的增高，人骨肉瘤U2OS細(xì)胞活性減小，丙泊酚對U2OS細(xì)胞的抑制呈時間、劑量依賴性。并且western blotting的結(jié)果也顯示Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP蛋白表達(dá)的升高，以及20 μg/ml丙泊酚處理組的前體Caspase-3的顯著降低，表明丙泊酚使U2OS細(xì)胞發(fā)生了凋亡。

Bcl-2蛋白家族通過控制線粒體膜通透性，在調(diào)節(jié)內(nèi)在凋亡途徑方面起著重要的作用。Bcl-2家族中促凋亡蛋白(Bid、tBid、Bax等)和抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1 等)相互作用調(diào)控線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性[14]。而Bax/Bcl-2的比值是線粒體凋亡機(jī)制中的重要指標(biāo)[15]，Bax/Bcl-2比值增高會持續(xù)開放線粒體外膜的膜滲透孔，釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與細(xì)胞進(jìn)入線粒體凋亡通路的初始執(zhí)行階段[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚抑制人骨肉瘤MG63細(xì)胞的侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。但對其細(xì)胞凋亡途徑尚未見具體報道。本研究中Bax蛋白表達(dá)隨丙泊酚濃度劑量依賴性增高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，這意味著丙泊酚對U2OS細(xì)胞的抑制可能是通過其內(nèi)在的線粒體凋亡途徑產(chǎn)生。

眾所周知，氧化應(yīng)激反應(yīng)尤其是活性氧自由基(ROS)聚集導(dǎo)致細(xì)胞凋亡在抗癌機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[18]。ROS直接或通過各種信號途徑使細(xì)胞內(nèi)脂類、蛋白質(zhì)及DNA等被氧化，尤其是線粒體蛋白遭受損害，引起細(xì)胞損傷[19]。丙泊酚由于其酚羥基與內(nèi)源性抗氧化劑維生素E結(jié)構(gòu)上類似，被認(rèn)為有一定的抗氧化應(yīng)激作用，然而其本身又可介導(dǎo)細(xì)胞損傷。在其引起U2OS細(xì)胞凋亡機(jī)制中本研究繼續(xù)觀察了其細(xì)胞內(nèi)ROS水平，發(fā)現(xiàn)其隨著丙泊酚濃度的增加其ROS水平增加，表明丙泊酚對U2OS的凋亡作用與ROS的積聚及其氧化損傷機(jī)制有關(guān)，這也與一些研究中丙泊酚通過氧化應(yīng)激介導(dǎo)細(xì)胞損傷的結(jié)果[20]一致。因此，丙泊酚通過ROS積聚引起的氧化應(yīng)激導(dǎo)致了U2OS細(xì)胞凋亡。

雖然，本研究僅研究了丙泊酚對U2OS細(xì)胞的影響，其細(xì)胞種類較單一，培養(yǎng)環(huán)境與臨床研究仍有一定的差異。但研究發(fā)現(xiàn)了丙泊酚呈劑量依賴性導(dǎo)致U2OS細(xì)胞凋亡，并深入研究了其通過ROS增多的線粒體凋亡機(jī)制，為骨肉瘤手術(shù)治療的麻醉藥物選擇提供了一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)。因此，更多的骨肉瘤細(xì)胞種屬以及動物研究及其更加深入的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。