緩釋TGF-β3的去細(xì)胞軟骨微絲/溫敏型水凝膠復(fù)合支架的制備

何林杰，廖鑫，潘逸男，黃義星

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 骨科，浙江 溫州 325027）

近年來由于經(jīng)濟(jì)水平的提高及人口的老齡化，因運(yùn)動損傷、交通意外及骨性關(guān)節(jié)炎等導(dǎo)致的軟骨缺損發(fā)生率急劇上升，其導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疼痛、功能障礙等癥狀嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。但由于關(guān)節(jié)軟骨本身無血供，且缺乏修復(fù)損傷的未分化細(xì)胞，加之軟骨細(xì)胞的低代謝活性和高密度的細(xì)胞外基質(zhì)的限制，使得其自身修復(fù)能力非常有限。目前的治療方法主要包括關(guān)節(jié)清理術(shù)、微骨折術(shù)、自體或異體骨軟骨移植、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等，這些治療方法均存在明顯的不足，如遠(yuǎn)期療效不佳、高額的治療費(fèi)用、有限的供體來源及免疫排異等[2-3]。本研究擬制備一種可注射且能緩釋TGF-β3的去細(xì)胞軟骨微絲/溫敏型水凝膠復(fù)合支架，并探討其誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）成軟骨分化的情況，期望能為臨床上治療軟骨缺損提供一種新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供4周齡，體質(zhì)量為160～200 g的雄性SPF級SD大鼠，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、聚乙烯亞胺（polyethyleneimine，PEI）、碳化二亞胺鹽酸鹽（carbodiimide hydrochloride，EDC）、羥基硫代琥珀酰亞胺（sNHS）購自上海阿拉丁公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethyl sulfonyl fluoride，PMSF）、聚賴氨酸（polylysine，PLL）、TritonX-100購自美國Sigma公司；Tris-HCl、Dnase、RNase購自北京索萊寶公司；SD大鼠BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒購自美國Cyagen Bioscience公司；TGF-β3購自美國Peprotech公司；Collagen II（Col II）抗體、Aggrecan（AGG）抗體、GAPDH抗體、DAPI購自美國Abcam公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；SOX9抗體購自美國Cell Signal Technology公司；BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 去細(xì)胞軟骨微絲的制備：①無菌條件下獲取兔新鮮肋軟骨，置于含蛋白酶抑制物PMSF的 10 mmol/L Tris-HCl緩沖液中離心5 min，清洗3次，低溫組織粉碎機(jī)粉碎軟骨組織，采用差速離心法獲取所需規(guī)格的軟骨微絲；②將離心后的軟骨微絲加入含1% Triton X-100的Tris-HCl緩沖液（pH 7.5內(nèi)含PMSF），恒溫震蕩機(jī)上震蕩8 h，去除細(xì)胞成分；4 ℃，7 000×g，離心5 min后，PBS液沖洗3次；③軟骨微絲在含有1 U/mL的RNase酶及50 U/mL的 DNase酶溶液中消化12 h，37 ℃，輕微攪拌，離心后PBS液反復(fù)離心沖洗，將沉淀配成30 g/L的乳狀懸液。將懸液均勻涂抹于載玻片上，顯微鏡下觀察其微觀結(jié)構(gòu)；④將軟骨微絲懸液-20 ℃冷凍過夜后，-80 ℃凍3 h，放入冷凍干燥機(jī)中凍干24 h，用DNA試劑盒提取DNA，使用酶標(biāo)儀定量法檢測DNA含量。

1.2.2 采用層層自組裝技術(shù)制備緩釋TGF-β3的去細(xì)胞軟骨微絲：首先用聚乙烯亞胺 （polyethyleneimine，PEI）對去細(xì)胞軟骨微絲進(jìn)行修飾，使基底材料表面帶上正電荷，隨后以HA為聚陰離子，以PLL為聚陽離子，在帶正電的基底上交替沉積，組裝得到（HA/PLL）多層膜，完成多層膜PEI-（HA/PLL）15多層膜。向完成層層自組裝的軟骨微絲中加入EDC和sNHS的混合溶液即刻吹打混勻后，靜置過夜，完成多層膜的交聯(lián)。次日7 000×g離心 5 min棄上清液，用PBS清洗離心3遍。TGF-β3通過后擴(kuò)散的方法裝載入（HA/PLL）多層膜。

1.2.3 復(fù)合支架的制備及TGF-β3緩釋實(shí)驗(yàn)：①4 ℃ 下將已組裝TGF-β3的軟骨微絲加入溫敏型水凝膠（PDLLA-PEG-PDLLA，由四川大學(xué)生物治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供），振蕩混勻，制成緩釋TGF-β3的去細(xì)胞軟骨微絲/溫敏型水凝膠復(fù)合支架，觀察復(fù)合支架在4 ℃、25 ℃和37 ℃時的形態(tài)；②取0.5 mL復(fù)合支架材料于離心管內(nèi)置于37 ℃成凝膠后，加入 37 ℃的1 mL PBS緩沖液進(jìn)行體外緩釋，每24 h更換1次PBS，每次換液將液體完全吸出，儲存于-20 ℃，再加入預(yù)熱好的37 ℃的PBS，使用TGF-β3 ELISA試劑盒檢測，制作TGF-β3緩釋曲線。

1.2.4 BMSCs的分離培養(yǎng)及與復(fù)合支架體外共培養(yǎng)：采用全骨髓貼壁法分離、培養(yǎng)股骨中的大鼠 BMSCs[4]。將大鼠安樂死，無菌環(huán)境下取下大鼠后肢，去除軟組織和肌肉。將股骨和脛骨浸泡于PBS中轉(zhuǎn)移至超凈臺，用含有10% FBS，1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基沖洗股骨和脛骨的骨髓腔。將細(xì)胞接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，并在37 ℃且含5% CO2中培養(yǎng)箱中生長。24 h后更換培養(yǎng)基除去非貼壁細(xì)胞。將剩余的貼壁細(xì)胞集落培養(yǎng)14 d，直至達(dá)到80%匯合，并用0.25%胰蛋白酶消化3 min后傳代。取3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。復(fù)合支架組：將支架材料用紫外線滅菌后平鋪于6孔板中孔中的一側(cè)（只覆蓋6孔板的1/3面積），置于37 ℃環(huán)境中凝固，將BMSCs以2×105個/孔的密度接種到含有復(fù)合支架的6孔板中，然后再加入SD大鼠BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。對照組：直接將BMSCs以2×105個/孔 的密度接種到空白的6孔板中，同樣加入等量的SD大鼠BMSCs成軟骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基。期間每3 d 更換1次培養(yǎng)基（所有培養(yǎng)基均為37 ℃預(yù)熱），培養(yǎng)21～28 d，電鏡下觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.5 Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平：使用蛋白質(zhì)裂解液（radio immunoprepciption assay buffer，RIPA）和1%的蛋白酶抑制劑 （phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）分別提取2組中的總蛋白質(zhì)，再使用BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒測定相應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度，并都配置成上樣量為30 μg，總體積為20 μL。上樣到SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉2 h，將對應(yīng)的PVDF膜與Col II、AGG和SOX9的一抗稀釋液置于4 ℃過夜。然后與相應(yīng)二抗室溫孵育2 h。加入ECL顯影液，于化學(xué)發(fā)光儀上曝光分析。比較2組Col II、AGG和SOX9的表達(dá)水平。

1.2.6 CCK-8法檢測細(xì)胞活性：復(fù)合支架組：先將消毒后的復(fù)合支架材料置于24孔板中的一角，于 37 ℃凝固，再將細(xì)胞以2×105個/孔接種于24孔板中，4 h后再加入500 μL/孔的完全培養(yǎng)基，使其沒過支架。對照組：直接將細(xì)胞以2×105個/孔接種于空白的24孔板中，4 h后再加入500 μL/孔的完全培養(yǎng)基。2組都在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，在各個檢測時間點(diǎn)，每孔用PBS洗3次，每次5 min，再加入490 μL DMEM、10 μL CCK-8工作液繼續(xù)培育2 h，吸取100 μL加入96孔板后置于酶標(biāo)儀測量450 nm處的吸光度值。并通過OD值計算公式計算復(fù)合支架組相對于對照組的細(xì)胞活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SSPS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用表示，兩組間的比較使用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組軟骨微絲組織學(xué)觀察及DNA定量檢測 軟骨微絲去細(xì)胞前，顯微鏡下可見基質(zhì)內(nèi)有大量的細(xì)胞成分；去細(xì)胞處理后，顯微鏡下未見細(xì)胞成分，細(xì)胞成分基本已被去除，軟骨微絲直徑一般小于100 μm，見圖1。去細(xì)胞前軟骨微絲中DNA含量為（49.52±7.12）μg/mg，去細(xì)胞后軟骨微絲中DNA含量為（5.36±0.56）μg/mg；去細(xì)胞后軟骨微絲中DNA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 2組軟骨微絲形態(tài)學(xué)

2.2 復(fù)合支架的溫敏特性及TGF-β3緩釋情況 TGF-β3 的去細(xì)胞軟骨微絲/溫敏型水凝膠復(fù)合支架在 4 ℃低溫狀態(tài)下為溶膠狀態(tài)，在25 ℃時仍為溶膠狀態(tài)，當(dāng)溫度升高至37 ℃時變?yōu)槟z狀態(tài)，具有良好的溫敏特性，見圖2A。繪制TGF-β3緩釋曲線圖可見TGF-β3能緩慢釋放，可有效釋放25 d左右，見 圖2B。

圖2 復(fù)合支架的溫敏特性及TGF-β3緩釋情況

2.3 BMSCs的獲取及其與復(fù)合支架共培養(yǎng)的情況 分離培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs，在顯微鏡下可見為短梭形或多角形，細(xì)胞兩端形成突起，見圖3A；BMSCs與復(fù)合支架共培養(yǎng)后，顯微鏡下見細(xì)胞呈現(xiàn)類似軟骨細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞輪廓清晰，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核明亮清楚，見圖3B。

2.4 2組Col II、AGG和SOX9表達(dá)比較 與對照組比，復(fù)合支架組的Col II、AGG和SOX9的表達(dá)均顯著增 加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖3 BMSCs的獲取及其與復(fù)合支架共培養(yǎng)的情況（×400）

表1 2組Col II、AGG和SOX9蛋白相對表達(dá)量比較

2.5 2組不同時間細(xì)胞活性測定 測定對照組和復(fù)合支架組第1、第2、第3、第4、第5、第6天的OD值，通過OD值計算公式計算復(fù)合支架組和對照組的細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），復(fù)合支架材料對BMSCs無細(xì)胞毒性，見圖4。

圖4 2組不同時間CCK-8法測定細(xì)胞的相對活性

3 討論

由于關(guān)節(jié)軟骨本身無血液供應(yīng)，使得軟骨損傷后的自身修復(fù)能力非常有限。目前的治療方法主要包括關(guān)節(jié)清理術(shù)、微骨折術(shù)、自體或異體骨軟骨移植、人工關(guān)節(jié)置換術(shù)等，這些治療方法均存在明顯的不足，如遠(yuǎn)期療效不佳、高額的治療費(fèi)用、有限的供體來源及免疫排異等問題[2-3]。而組織工程技術(shù)作為一種可選擇的替代修復(fù)方式，為臨床上治療軟骨缺損開辟了一條新路徑[5-6]。

利用組織工程方法進(jìn)行軟骨修復(fù)需具備3個核心條件：①足夠數(shù)量、功能正常、具有軟骨分化能力的種子細(xì)胞；②調(diào)節(jié)種子細(xì)胞增殖、分化，并維持其表型特征的細(xì)胞因子；③具有良好生物相容性、可無毒降解、合適空隙大小和孔隙率的三維支架。BMSCs來源充足，獲取相對簡便，具有強(qiáng)大的自我增殖及多向分化的能力，而且隨著細(xì)胞的擴(kuò)增，細(xì)胞的性狀和分化特性并不會改變和喪失。在特定的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，BMSCs能分化為軟骨細(xì)胞，被認(rèn)為是軟骨組織工程最有發(fā)展?jié)摿Φ姆N子細(xì)胞[7]。

此外，人們已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞生長因子參與并調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)過程，其中起主要誘導(dǎo)作用、研究最為深入的是TGF-β[8]。TGF-β有3個亞型，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，它們均可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，并能促進(jìn)軟骨特異性基質(zhì)的合成，從而促進(jìn)軟骨修復(fù)[9-10]。相關(guān)研究表明，TGF-β3可能更適合于軟骨損傷的組織工程修復(fù)[11]。

支架材料大致可分為天然支架材料、人工合成支架材料及復(fù)合支架材料。目前已有多種軟骨再生支架材料被應(yīng)用于誘導(dǎo)軟骨再生，但各種支架材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，目前尚無公認(rèn)的理想支架材料。天然支架材料是生物機(jī)體的成分，生物相容性好，有利于細(xì)胞黏附、增殖和分化，與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，理論上可以為種子細(xì)胞提供最佳的生存條件，但其存在力學(xué)性能較差、降解速度太快等缺點(diǎn)。去細(xì)胞基質(zhì)材料是對天然的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行處理，剔除其中的抗原成分，具有良好的生物相容性、能為細(xì)胞提供接近體內(nèi)的生存環(huán)境。人工合成支架材料的優(yōu)點(diǎn)是具有較好的生物相容性，來源廣泛、容易獲得且可大批量生產(chǎn)，其空間結(jié)構(gòu)、大體形態(tài)、機(jī)械強(qiáng)度、降解時間等都能預(yù)先設(shè)計和調(diào)控。其中以水凝膠為代表的人工合成支架材料是一類比較受關(guān)注的仿生支架材料。水凝膠是以水為分散介質(zhì)的凝膠，能保持一定的形狀，結(jié)構(gòu)特征與細(xì)胞外基質(zhì)相似。它具有以下優(yōu)點(diǎn)[12-14]：①前體呈液態(tài)，可使細(xì)胞、藥物等有形成分較均勻地分布于其中；②可使用注射的微創(chuàng)方式將材料植入任意不規(guī)則的缺損部位；③在膠凝化的過程中可滲入鄰近組織，提高支架與周圍組織的附著整合能力；④膠凝化后形成的三維結(jié)構(gòu)有助于細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-支架之間的相互作用。但合成材料表面沒有天然材料所具有的特定的細(xì)胞識別信號，細(xì)胞的黏附性較差，不利于細(xì)胞的增殖分化和基質(zhì)的合成。

本實(shí)驗(yàn)制備的緩釋TGF-β3的去細(xì)胞軟骨微絲/溫敏型水凝膠復(fù)合支架，兼具天然支架材料和人工合成支架材料的優(yōu)點(diǎn)，具有良好的生物相容性，能為細(xì)胞提供接近體內(nèi)的生存環(huán)境，利于細(xì)胞的增殖分化和基質(zhì)的合成；同時還具有溫敏特性，在低溫狀態(tài)下為溶膠，當(dāng)溫度升高至體溫附近時變?yōu)槟z，因此可使用微創(chuàng)注射的方法達(dá)到軟骨缺損部位，充填任意形狀的缺損。此外，通過層層自組裝技術(shù)將TGF-β3組裝到去細(xì)胞軟骨微絲上，使TGF-β3能長久緩慢釋放，避免了生長因子半衰期短、容易降解等不利因素，充分發(fā)揮其生物學(xué)功能，較好地誘導(dǎo)BMSCs成軟骨分化與增殖。國內(nèi)外的一些研究發(fā)現(xiàn)溫敏型水凝膠對藥物和生長因子亦具有緩釋作 用[15-16]。因此，本研究制備的能緩釋TGF-β3的去細(xì)胞軟骨微絲與溫敏型水凝膠復(fù)合后的緩釋作用可能更佳。將BMSCs與復(fù)合支架共培養(yǎng)后，軟骨細(xì)胞的特異性表達(dá)指標(biāo)Col II、AGG和SOX9較對照組顯著增加，說明復(fù)合支架對BMSCs向軟骨細(xì)胞分化有明顯促進(jìn)作用。

這種可注射且能緩釋TGF-β3的去細(xì)胞軟骨微絲/溫敏型水凝膠復(fù)合支架，能有效緩釋TGF-β3，為臨床上治療軟骨缺損提供了一種新思路。