許氏平鲉幼魚(yú)對(duì)飼料中維生素B6 需求量的研究*

周 瑩 王際英 李寶山 王成強(qiáng) 王世信 孫永智 馬長(zhǎng)興

(1. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心 上海 201306；2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 煙臺(tái) 264006)

維生素B6是一種水溶性維生素，以吡哆醇、吡哆醛和吡多胺3種形式存在(Halsted, 2003)。維生素B6與生物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝密切相關(guān)。首先，維生素B6作為生物體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶和脫羧酶的輔酶，參與催化氨基酸轉(zhuǎn)氨、脫羧、消旋、脫硫和裂解等反應(yīng)，在氨基酸代謝中起重要作用(Shiau et al, 2003)；其次，作為糖原磷酸化酶的輔酶參與碳水化合物代謝，為糖異生提供碳架，維持血糖濃度；同時(shí)，其與必需脂肪酸的代謝、mRNA的合成，糖皮質(zhì)激素及白蛋白的基因表達(dá)有關(guān)(Zehra et al, 2018; Natori et al, 1997)；此外，它還參與神經(jīng)物質(zhì)如γ-氨基丁酸(GABA)、多巴胺、組胺、5-羥色胺(5-HT)等的生物合成，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能(Huang et al, 2005; Akhtar et al,2010)。水產(chǎn)動(dòng)物缺乏維生素B6會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的缺乏癥，但維生素B6過(guò)量并不會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物產(chǎn)生明顯的毒副作用。通過(guò)生長(zhǎng)指標(biāo)、肝臟維生素B6的含量、轉(zhuǎn)氨酶活性等評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定了水產(chǎn)動(dòng)物維生素B6的需求量約為1～12 mg/kg(He et al, 2009; Zehra et al, 2018;Hosokawa et al, 1992)，其中，斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)維 生 素B6需 求 量 為1.75～2.22 mg/kg(Huang et al, 2005)，缺乏時(shí)表現(xiàn)為厭食，生長(zhǎng)不良，驚厥，螺旋狀游泳等；大菱鲆(Scophthalmus maximus)維生素B6需求量為1～2.5 mg/kg(Adron et al, 1978)，缺乏時(shí)表現(xiàn)為生長(zhǎng)不良，厭食，運(yùn)動(dòng)失調(diào)，水腫，神經(jīng)紊亂等；金頭鯛(Spatrus aurata) 維生素B6需求量為1.97 mg/kg (Kissil et al, 1981)，缺乏時(shí)表現(xiàn)為生長(zhǎng)遲緩，死亡率高，游泳行為不穩(wěn)定和周?chē)窠?jīng)退行性改變等。

許氏平鲉(Sebastes schlegeli)，隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉屬(Sebastes)，又稱(chēng)黑鲪、黑頭等，是一種冷溫性卵胎生的魚(yú)類(lèi)，分布于我國(guó)黃海、渤海和東海，國(guó)外分布于朝鮮、日本和鄂霍次克海南部(劉蟬馨, 1988; 朱龍等, 1999)。許氏平鲉肉質(zhì)鮮美，在沿海有黑石斑的美譽(yù)，是人工魚(yú)礁資源增殖和網(wǎng)箱養(yǎng)殖的理想種類(lèi)(冒樹(shù)泉等, 2014)。目前，關(guān)于許氏平鲉營(yíng)養(yǎng)需求研究主要涉及蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)、礦物質(zhì)及飼料添加劑等方面(Lee et al,2002、2009; Cho et al, 2015; Katya et al, 2017)，維生素營(yíng)養(yǎng)需求的報(bào)道僅見(jiàn)維生素C (Lee et al, 1998)和維生素E (Bai et al, 1998)，B 族維生素研究方面尚處于空白。本研究通過(guò)在飼料中添加不同梯度的維生素B6，研究其對(duì)生長(zhǎng)、肝臟酶活和轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)等指標(biāo)的影響，確定許氏平鲉幼魚(yú)對(duì)維生素B6的最適需求量，為其配合飼料的開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料

以魚(yú)粉、酪蛋白為主要蛋白源，魚(yú)油為主要脂肪源，設(shè)計(jì)粗蛋白約為49.56%、粗脂肪約為9.12%的基礎(chǔ)飼料配方。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、1、2、4、8和32 mg/kg 的鹽酸吡哆醇(純度為98.6%，購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司)，配制維生素B6實(shí)際含量為 2.08、3.25、4.16、6.32、10.17 和 31.14 mg/kg 6 組等氮等能的實(shí)驗(yàn)飼料，命名為D1、D2、D3、D4、D5 和D6 組，其中，D1 為對(duì)照組。表1 為實(shí)驗(yàn)飼料的配方及營(yíng)養(yǎng)組成。

各原料經(jīng)粉碎過(guò)80 目標(biāo)準(zhǔn)篩，按配比稱(chēng)重后，逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻，添加魚(yú)油和適宜的蒸餾水，再次混合混勻，用小型飼料擠壓機(jī)制成粒徑為2 和4 mm的顆粒飼料，60℃烘干，用塑料袋密封后于–20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)及飼養(yǎng)管理

實(shí)驗(yàn)所用許氏平鲉幼魚(yú)購(gòu)自山東日照傳真養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在山東日照片聯(lián)綠色養(yǎng)殖示范基地的水泥養(yǎng)殖池內(nèi)掛網(wǎng)箱(60 cm×60 cm×50 cm)中進(jìn)行。正式實(shí)驗(yàn)前采用對(duì)照組飼料馴化，14 d 后挑選體質(zhì)健壯、大小均一、初始體重為(36.35±0.06) g 的實(shí)驗(yàn)魚(yú)540 尾。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為6 個(gè)組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)網(wǎng)箱30 尾魚(yú)，共18 個(gè)網(wǎng)箱。養(yǎng)殖期間持續(xù)充氣，養(yǎng)殖用水為深井海水，采用流水養(yǎng)殖。水溫為16℃～18℃，溶解氧(DO)>5.0 mg/L，pH 為7.0 左右，氨氮和亞硝態(tài)氮<0.05 mg/L。每天08:00 和16:00 投喂2 次，初始投喂量為魚(yú)體重的1%，并按其攝食情況調(diào)整，每日記錄死魚(yú)數(shù)量和重量。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行63 d。

1.3 樣品采集及分析

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，記錄每個(gè)網(wǎng)箱魚(yú)的數(shù)量并稱(chēng)重，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取4 尾魚(yú)，用于魚(yú)體常規(guī)成分測(cè)定，另取8 尾魚(yú)測(cè)量體重及體長(zhǎng)后，尾靜脈取血，解剖分離內(nèi)臟，分別稱(chēng)量?jī)?nèi)臟團(tuán)、肝胰臟、腸道的重量。全魚(yú)、背肌、肝臟樣品置于–80℃條件下保存，待測(cè)。每桶中隨機(jī)取2 尾魚(yú)，無(wú)菌環(huán)境下解剖，取肝尖置于無(wú)RNase 離心管中并迅速置于液氮中速凍，后于–80℃超低溫冰箱中保存，用于組織中相關(guān)基因表達(dá)量的分析。

實(shí)驗(yàn)飼料及樣品中水分采用105℃恒重法測(cè)定(GB/T6435-2014)，粗蛋白采用凱氏定氮法測(cè)定(GB/T6432-2018)，粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定(GB/T6433-2006)，粗灰分采用550℃失重法測(cè)定(GB/T 6438-2007)，能量采用燃燒法測(cè)定(IKA, C6000, 德國(guó))。

肝臟中維生素B6的含量采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司試劑盒測(cè)定。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic oxalacetic transaminase, GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic transaminase, GPT)均采用南京建成生物工程的試劑盒進(jìn)行測(cè)定，肝臟組織蛋白含量采用考馬斯亮蘭法測(cè)定，酶活力單位定義參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

使用Trizol 法提取總RNA，提取完成后使用核酸蛋白儀(Nanoprop 2000，美國(guó))檢驗(yàn)RNA 的濃度，并使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)去除基因組DNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA 后于–80℃保存待用。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室所得的許氏平鲉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，找到谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT1 和GOT2)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT1 和GPT2)、酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)、絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerC)的基因序列，NCBI Nucleotide BLAST 進(jìn)行同源性比對(duì)分析，確定同源性較高的基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，選用核糖體蛋白L17(RPL17)作為內(nèi)參基因(Ma et al,2013)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列如表2 所示。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒為T(mén)aKaRa 的TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)。PCR 程序：95℃預(yù)變性30 s，1 個(gè)循環(huán)；95℃變性5 s，相應(yīng)基因退火溫度下退火30 s，72℃延伸60 s，共40 個(gè)循環(huán)后增長(zhǎng)至95℃。通過(guò)熒光定量PCR 儀得出目的基因及內(nèi)參基因的Ct 值，按照2–??Ct計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。本研究中，RPL17、GOT1、GOT2、GPT1、GPT2、TAT 和SerC 的擴(kuò)增效率分別為0.992、0.962、0.979、0.965、0.989、1.055 和1.027。

表2 基因表達(dá)的引物序列Tab.2 Primer sequences for gene expression

1.4 指標(biāo)計(jì)算及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=(魚(yú)體末重–魚(yú)體初重)/魚(yú)體初重×100；

特定生長(zhǎng)率(Specific growth rate, SGR, %/d) =(ln魚(yú)體末重–ln 魚(yú)體初重)/養(yǎng)殖周期×100；

攝食率(Feed intake, FI, %/d)=攝食飼料量/[(魚(yú)體初重+魚(yú)體末重)/2×養(yǎng)殖天數(shù)] ×100；

飼料系數(shù)(Feed conversion ratio, FCR)=攝食飼料量/(魚(yú)體末重–魚(yú)體初重)；

蛋白質(zhì)效率(Protein efficiency ratio, PER, %)=(魚(yú)體末重–魚(yú)體初重)/(攝食飼料量×飼料中粗蛋白的含量)×100；

臟體比(Viscerosomtic index, VSI, %)=內(nèi)臟團(tuán)重/魚(yú)體末重×100；

肝體比(Hepatosomatic index, HSI, %)=肝臟重/魚(yú)體末重×100；

腸體比(Intestine-somatic index, ISI,%)=腸道重/魚(yú)體末重×100；

肥滿度(Condition factor, CF)=魚(yú)體末重/體長(zhǎng)3×100；

存活率(Survival rate, SR, %)=終末魚(yú)尾數(shù)/初始魚(yú)尾數(shù)×100。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。每組數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，差異顯著(P<0.05)時(shí)用Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析。采用折線模型擬合數(shù)據(jù)，確定許氏平鲉維生素B6的最適需求量。

2 結(jié)果

2.1 飼料中維生素B6對(duì)許氏平 鲉幼魚(yú)生長(zhǎng)和形體指標(biāo)的影響

由表3 可知，隨著維生素B6含量的升高，實(shí)驗(yàn)魚(yú)增重率和特定生長(zhǎng)率呈先上升后下降的趨勢(shì)，D3組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。D2～D6 組的攝食率無(wú)顯著差異(P>0.05)，均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。D3 組飼料系數(shù)最低，D3～D6 組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。蛋白質(zhì)效率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，D3 組最高。D3 組的臟體比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；D2～D5 組的肝體比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；D2～D6 組的腸體比顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，呈先升后降的趨勢(shì)，在D3 組達(dá)到最高值；各組間的肥滿度和存活率無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料中維生素B6 對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)生長(zhǎng)和形體指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of dietary vitamin B6 on growth performance and body indices of juvenile S. schlegeli

圖1 許氏平鲉幼魚(yú)增重率與飼料中維生素B6 含量的折線回歸關(guān)系Fig.1 The broken-line regression analysis based on weight gain rate and dietary vitamin B6 of juvenile S. schlegeli

以增重率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)折線模型擬合后得許氏平鲉幼魚(yú)對(duì)飼料維生素B6的需求量為3.53 mg/kg(圖1)。

2.2 飼料中維生素B6對(duì)許氏平 鲉幼魚(yú)魚(yú)體常規(guī)成分的影響

由表4 可知，維生素B6含量對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)全魚(yú)水分和粗灰分含量無(wú)顯著影響(P>0.05)，全魚(yú)粗蛋白呈先上升后下降的趨勢(shì)，D3～D6 組的全魚(yú)粗蛋白顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且在D4 組達(dá)到最高值；全魚(yú)粗脂肪呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照組有最低值，D5組有最高值，D3～D6 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

許氏平鲉幼魚(yú)D3～D6 組肌肉水分含量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；肌肉粗蛋白隨著維生素B6含量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照組含量最低，D3～D6組無(wú)顯著差異(P>0.05)；對(duì)照組肌肉粗脂肪呈先上升后下降的趨勢(shì)，D4 組最高；肌肉粗灰分含量無(wú)顯著變化(P>0.05)。

表4 飼料中維生素B6 對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)魚(yú)體常規(guī)成分的影響(%濕重)Tab.4 Effects of dietary vitamin B6 on proximate composition of juvenile S. schlegeli (% wet weight)

2.3 飼料中維生素B6 對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)肝臟酶活及維生素B6 含量的影響

由表5 可知，隨著維生素B6含量的增加，肝臟超氧化物歧化酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，D3～D5組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，D3 組最高。丙二醛含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，D2～D6 組顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，D3 組最低。D2～D6 組的肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶活力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，D4～D6 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，D3～D6 組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。肝臟維生素B6含量隨著飼料維生素B6含量的增加，呈先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)，D2～D6 組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，D3～D6 組間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

以肝臟維生素B6含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)折線模型擬合后得許氏平鲉幼魚(yú)對(duì)飼料維生素B6的需求量為4.96 mg/kg(圖2)；以肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，經(jīng)折線模型擬合后得許氏平鲉對(duì)飼料維生素B6的需求量為6.32 mg/kg(圖3)。

2.4 飼料中維生素B6 對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)量的影響

隨著維生素B6含量的增加，谷草轉(zhuǎn)氨酶1(GOT1)基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，D4 組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，D3～D6 組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖4)；D2～D6 組谷草轉(zhuǎn)氨酶2(GOT2)基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P>0.05)，D3 組為最大值，D4～D6 組間差異不顯著(P>0.05)(圖5)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶1(GPT1)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶2(GPT2)基因相對(duì)表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)，均在D4 組有最大值，且顯著高于對(duì)照組和D2 組(P<0.05)，D3～D6 組差異不顯著(P>0.05)(圖6 和圖7)；酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)呈先上升后下降的趨勢(shì)，D4 組有最大值，D3～D5 組顯著高于其他組(P<0.05)(圖8)；絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerC)呈下降趨勢(shì)，D3～D6 組顯著低于對(duì)照組和D2 組(P<0.05)，D6 組為最低值(圖9)。

表5 飼料中維生素B6 對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)肝臟酶活及維生素B6 含量的影響Tab.5 Effects of dietary vitamin B6 on liver enzyme activities and vitamin B6 content of juvenile S. schlegeli

圖2 許氏平鲉幼魚(yú)肝臟維生素B6 含量與飼料中維生素B6 含量的折線回歸關(guān)系Fig.2 The broken-line regression analysis based on liver vitamin B6 content and dietary vitamin B6 content of juvenile S. schlegeli

圖3 許氏平鲉幼魚(yú)肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性與飼料中維生素B6 含量的折線回歸關(guān)系Fig.3 The broken-line regression analysis based on liver glutamic-pyruvic transaminase and dietary vitamin B6 content of juvenile S. schlegeli

圖4 肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶1(GOT1)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The relative expression level of the glutamic oxalacetic transaminase1(GOT1) mRNA in liver

圖5 肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶2 (GOT2)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The relative expression level of the glutamic oxalacetic transaminase2(GOT2) mRNA in liver

3 討論

3.1 飼料中維生素B6含量對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)生長(zhǎng)的影響

圖6 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶1(GPT1)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 The relative expression level of the glutamic-pyruvic transaminase 1(GPT1) mRNA in liver

圖7 肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶2(GPT2)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.7 The relative expression level of the glutamic-pyruvic transaminase 2(GPT2) mRNA in liver

圖8 肝臟酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression level of the tyrosine aminotransferase (TAT) mRNA in liver

圖9 肝臟絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerC)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.9 The relative expression level of the serine aminotransferase (SerC) mRNA in liver

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)照組的增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著低于其他組，且隨著維生素B6含量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，說(shuō)明維生素B6是維持許氏平鲉正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。維生素B6在多種代謝過(guò)程中起作用，它的缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)合成和轉(zhuǎn)化反應(yīng)的錯(cuò)位，在飼料中添加適量的維生素B6會(huì)提高蛋白質(zhì)的利用率(Baker et al, 1995)。本研究中，添加維生素B6組的蛋白質(zhì)效率顯著高于對(duì)照組，飼料系數(shù)呈先降后升的趨勢(shì)，飼料利用率有所提高。水產(chǎn)動(dòng)物缺乏維生素 B6會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀，如黃尾(Seriolalalandi)出現(xiàn)厭食，生長(zhǎng)不良，貧血，神經(jīng)紊亂和高死亡率的缺乏癥(Hosokawa et al, 1992)；條石鯛(Oplegnathus fasciatus)的缺乏癥是生長(zhǎng)緩慢，厭食，神經(jīng)失調(diào)，游泳異常，高死亡率和貧血(Ishibashi et al, 2002)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組未出現(xiàn)常見(jiàn)的維生素B6缺乏癥，有可能因?yàn)閷?shí)驗(yàn)開(kāi)始前，許氏平鲉幼魚(yú)體內(nèi)積累了一部分維生素B6；養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在水泥池掛網(wǎng)箱中進(jìn)行，水體中也有部分維生素B6的存在，而不能及時(shí)排出；攝食飼料中也添加了魚(yú)粉(含有一些維生素B6)，因此，對(duì)照組缺乏癥不明顯，只出現(xiàn)了攝食不積極的癥狀，但存活率較其他組無(wú)顯著差異，說(shuō)明2.08 mg/kg 的維生素B6可以防止許氏平鲉幼魚(yú)出現(xiàn)嚴(yán)重的缺乏癥。

本實(shí)驗(yàn)以增重率、肝臟維生素B6含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得出許氏平鲉幼魚(yú)維生素B6的需求量為3.53～6.32 mg/kg，與印度鯰(Heteropneustes fossilis)3.21 mg/kg(Mohamed, 2001)、紅羅非魚(yú)(Oreochromis mossambicus × O. niloticus) 3 mg/kg(Lim et al, 1995)、大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea) 4.49～4.61 mg/kg(張春曉,2006)、鱸魚(yú)(Lateolabrax japonicus) 4.38～4.53 mg/kg(張春曉, 2006)、團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)4.17～ 5.02 mg/kg (王瑩等, 2013)的需求量類(lèi)似；高于大菱鲆1～2.5 mg/kg(Adron et al, 1978)、斜帶石斑魚(yú)1.75～2.22 mg/kg(Huang et al, 2005)的需求量；低于翠鱧(Channa punctatus) 7.6～10.4 mg/kg(Zehra et al,2018)、黃尾2.2～11.7 mg/kg(Hosokawa et al, 1992)、吉富羅非魚(yú)(Oreochromis niloticus) 9.22～10.11 mg/kg(吳凡等, 2018)的需求量。不同實(shí)驗(yàn)魚(yú)有不同需求量，原因可能與實(shí)驗(yàn)魚(yú)的種類(lèi)、大小、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、實(shí)驗(yàn)飼料、飼喂頻率和方式、實(shí)驗(yàn)方法和評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)。

魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)可以通過(guò)形體指標(biāo)來(lái)反映，如臟體比、肝體比和腸體比。研究表明，未添加維生素B6時(shí)，吉富羅非魚(yú)和異育銀鯽(Carassius auratas gibelio)肝體比顯著低于其他組(吳凡等, 2018; 王錦林等,2011)；大西洋鮭(Salmo salar)10 mg/kg 組的肝體比顯著高于其他組(Albrektsen et al, 1994)；建鯉(Cyprinus carpio)對(duì)照組的腸體比為最低值(He et al, 2009)，本實(shí)驗(yàn)的臟體比、肝體比和腸體比均呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照組最低，說(shuō)明維生素B6不足可能會(huì)影響許氏平鲉幼魚(yú)的器官發(fā)育能力。

3.2 飼料中維生素B6 對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)魚(yú)體常規(guī)成分的影響

隨維生素B6的增加，許氏平鲉幼魚(yú)全魚(yú)粗蛋白、全魚(yú)和肌肉的粗脂肪呈先上升后下降的趨勢(shì)，肌肉粗蛋白含量先上升后趨于平穩(wěn)，對(duì)照組肌肉水分顯著低于其他各組，這與吉富羅非魚(yú)(吳凡等, 2018)、異育銀鯽(王錦林等, 2011)的研究結(jié)果類(lèi)似。維生素B6以5’-磷酸吡哆醛的形式作為轉(zhuǎn)氨酶的輔酶，參與氨基酸分解代謝的第一步去除α-氨基，使氨基酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酮酸。維生素B6含量的增加會(huì)提高魚(yú)體蛋白利用率，增加機(jī)體蛋白的含量，促進(jìn)蛋白的合成(Baker et al,1995; Giri et al, 1997)；因此，全魚(yú)和肌肉的粗蛋白含量會(huì)隨維生素B6含量的增加而有所提高。此外，維生素B6在乙酰輔酶A 和脂肪酸利用等方面的脂質(zhì)代謝中起重要作用。在草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)和皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus hannai)中發(fā)現(xiàn)添加維生素B6可以調(diào)節(jié)和平衡多不飽和脂肪酸的代謝，有助于脂蛋白酯酶等的合成與釋放，促進(jìn)了脂肪的運(yùn)輸和利用，避免了脂質(zhì)的沉積(馮秀妮, 2005; 黃世蕉等, 1992)。本研究中，對(duì)照組全魚(yú)和肌肉的粗脂肪含量顯著低于其他各組，隨著維生素B6的增加，D5、D6 組肌肉的粗脂肪和D6 組全魚(yú)的粗脂肪出現(xiàn)了下降，在印度鯪(Cirrhinus mrigala)的研究上也有類(lèi)似結(jié)果(Zehra et al, 2017)。大西洋鮭未添加維生素B6組的全魚(yú)和肝臟脂質(zhì)含量最低(Albrektsen et al, 1994)。以上結(jié)果說(shuō)明，添加適量的維生素B6，能促進(jìn)機(jī)體蛋白質(zhì)的合成和脂質(zhì)代謝反應(yīng)的正常進(jìn)行。

3.3 飼料中維生素B6對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)肝臟維生素B6含量和抗氧化酶的影響

維生素B6在氨基酸代謝和含氮化合物的反應(yīng)中充當(dāng)氨基轉(zhuǎn)移酶和脫羧酶的輔酶，參與非必需氨基酸的合成(Baker et al, 1995)。魚(yú)類(lèi)肝臟是維生素代謝和蓄積的重要器官，腸道吸收的水溶性維生素被運(yùn)送到肝臟，以滿足新陳代謝的需要，肝臟中維生素B6的含量常作為特征性的評(píng)價(jià)指標(biāo)(Zehra et al, 2017)。因此，測(cè)定肝臟中維生素B6的含量能更好的確定維生素B6的需求量。通過(guò)折線回歸模型，以肝臟維生素B6含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，許氏平鲉幼魚(yú)維生素B6需求量為4.96 mg/kg。

維生素B6具有間接的抗氧化作用，可以清除機(jī)體超氧化物自由基并進(jìn)一步預(yù)防氧化應(yīng)激，而缺乏維生素B6會(huì)增加自由基的生成、降低抗氧化酶活性(Kumar et al, 2017)?？寡趸锩缸鳛轸~(yú)體抗氧化防御的重要組成部分，其中，SOD 是一類(lèi)抗氧化酶，從細(xì)胞環(huán)境中清除具有破壞性的活性氧(ROS)，具有清除體內(nèi)自由基的能力，抑制超氧化物的生成，在機(jī)體的防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用(胡凱,2008; Cui et al, 2016)。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，含量可反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度(Mccord, 1969)。在斜帶石斑魚(yú)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)的研究中發(fā)現(xiàn)，維生素B6缺乏組SOD 活性顯著降低(Huang et al, 2005; 黃曉玲,2014)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，隨著飼料維生素B6含量的增加，SOD 活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，MDA 呈先下降后上升的趨勢(shì)，均在D3 組出現(xiàn)極值，這表明添加適當(dāng)含量的維生素B6可以提高機(jī)體的抗氧化能力。

3.4 飼料中維生素B6 對(duì)許氏平鲉幼魚(yú)肝臟轉(zhuǎn)氨酶活力及其基因表達(dá)量的影響

維生素B6以5’-磷酸吡哆醛的形式，作為轉(zhuǎn)氨酶參與氨基酸代謝的標(biāo)志性輔酶(Zehra et al, 2018)，肝臟作為氨基酸代謝的主要場(chǎng)所，肝臟的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶常被用作評(píng)價(jià)魚(yú)體營(yíng)養(yǎng)狀況的敏感指標(biāo)，其活力間接反映蛋白質(zhì)合成效率，同時(shí)，也是反映肝功能是否正常的重要指標(biāo)(陳壯等, 2014; 馬俊等,2016; Smith et al, 1974)。故測(cè)定肝臟中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力可以更準(zhǔn)確得出維生素B6的需求量。本研究表明，對(duì)照組肝臟維生素B6含量和轉(zhuǎn)氨酶活力均顯著低于其他組，隨著維生素B6含量的增加，肝臟維生素B6含量呈先上升后平穩(wěn)的趨勢(shì)；谷草轉(zhuǎn)氨酶呈上升的趨勢(shì)，但在D3～D6 組無(wú)顯著差異；谷丙轉(zhuǎn)氨酶呈先上升后下降的趨勢(shì)。這與吉富羅非魚(yú)、異育銀鯽和印度鯰的研究結(jié)果類(lèi)似(Mohamed,2001; 吳凡等, 2018; 王錦林等, 2011)，說(shuō)明添加維生素B6可以提高轉(zhuǎn)氨酶的活力，保證魚(yú)體蛋白質(zhì)代謝的正常進(jìn)行。通過(guò)折線回歸模型，以谷丙轉(zhuǎn)氨酶為評(píng)價(jià)指標(biāo)，許氏平鲉幼魚(yú)維生素B6需求量為6.32 mg/kg。

GOT 在真核細(xì)胞中存在2 種遺傳上不同的同工酶，細(xì)胞質(zhì)和線粒體蛋白分別由GOT1 和GOT2 基因編碼(Jiang et al, 2015)；GPT 基因也常分為2 個(gè)亞型，即肝細(xì)胞質(zhì)中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶1(GPT1)和位于肝線粒體中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶2(GPT2)(荊曉麗, 2010)。目前，在水產(chǎn)動(dòng)物上尚無(wú)關(guān)于維生素B6對(duì)轉(zhuǎn)氨酶基因表達(dá)水平影響的報(bào)道，但研究發(fā)現(xiàn)，維生素B6缺乏的大鼠(Rattus norvegicus)肝臟細(xì)胞質(zhì)的谷草轉(zhuǎn)氨酶mRNA水平比對(duì)照組高7 倍，施用皮質(zhì)醇可以誘導(dǎo)肝谷草轉(zhuǎn)氨酶 mRNA 的表達(dá)，而給予維生素B6會(huì)抑制由皮質(zhì)醇誘導(dǎo)的谷草轉(zhuǎn)氨酶的合成；缺乏維生素B6會(huì)增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素受體的DNA 結(jié)合活性，提高谷草轉(zhuǎn)氨酶的基因表達(dá)(Kondo et al, 1985; Oka et al, 1995)。研究表明，維生素B6缺乏不但降低了肝臟丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶活性，而且還下調(diào)了肝細(xì)胞丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶的基因表達(dá)(Nishijima et al, 2003)。給大鼠喂食缺乏維生素B6的飼料后，丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶1 活性的降低比丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶2 活性(在14 d 內(nèi)降低33%相比86%)更快速和顯著(Takada et al, 1984)。5’-磷酸吡哆醛(PLP)作為糖皮質(zhì)激素受體的體內(nèi)調(diào)節(jié)劑，PLP 水平變化會(huì)影響糖皮質(zhì)激素受體的DNA 結(jié)合位點(diǎn)，并最終影響酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAT)的活性(Disorbo et al, 1981)。絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(SerC)參與氨基酸合成通路的表達(dá)，使谷氨酸轉(zhuǎn)氨基生成3-磷酸絲氨酸，SerC 基因作為調(diào)控和關(guān)鍵酶參與L-絲氨酸的合成(劉浩等, 2015)，維生素B6作為所有轉(zhuǎn)氨酶的輔酶，也會(huì)影響絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)水平。

本研究中，隨著飼料中維生素B6含量的升高，GOT1 的mRNA 基因表達(dá)呈先上升后下降的趨勢(shì)，對(duì)照組的基因表達(dá)量顯著低于其他各組，D3～D6 組間沒(méi)有顯著差異；GOT2 的對(duì)照組基因表達(dá)水平最低，D3 組高表達(dá)，以上結(jié)果表明，添加維生素B6會(huì)提高谷草轉(zhuǎn)氨酶的基因表達(dá)。GPT1 和GPT2 的mRNA 基因表達(dá)水平呈相似的趨勢(shì)，均是先升高后降低，且在D4 組表達(dá)量最高，對(duì)照組表達(dá)量最低，由此可見(jiàn)，維生素B6缺乏會(huì)降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶的基因表達(dá)，適宜的維生素B6添加會(huì)使其高表達(dá)。同時(shí)，TAT 的基因表達(dá)水平也是對(duì)照組最低，在D3～D5 組表達(dá)量顯著高于對(duì)照組、D2 和D6 組。SerC 基因表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，對(duì)照組和D2 組表達(dá)量顯著高于D3～D6 組。本研究結(jié)果與以上結(jié)論有差異的原因可能是物種、實(shí)驗(yàn)條件和方法、實(shí)驗(yàn)形式等所致。

隨著維生素B6的添加，谷草轉(zhuǎn)氨酶活力呈上升趨勢(shì)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力先升后降，這與mRNA 表達(dá)水平趨勢(shì)類(lèi)似，說(shuō)明適宜含量的維生素B6能促進(jìn)谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶基因的轉(zhuǎn)錄，提高谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活力，促進(jìn)魚(yú)體蛋白質(zhì)合成效率和利用率，更好的調(diào)控許氏平鲉幼魚(yú)的蛋白質(zhì)代謝。此外，添加維生素B6會(huì)上調(diào)酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)量，下調(diào)絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)量，具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

4 結(jié)論

綜上，維生素B6是許氏平鲉幼魚(yú)生長(zhǎng)發(fā)育和維持正常生理功能的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。適宜含量的維生素B6可以提高許氏平鲉幼魚(yú)抗氧化能力和代謝酶活性，提高谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和酪氨酸的基因表達(dá)水平，降低絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶的基因表達(dá)水平。以增重率、肝臟維生素B6含量和谷丙轉(zhuǎn)氨酶為評(píng)價(jià)指標(biāo)，36 g 的許氏平鲉幼魚(yú)維生素B6的需求量為3.53～6.32 mg/kg 飼料。