固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定番茄中春雷霉素的殘留量

楊 梅

（上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司食品部，上海 200233）

春雷霉素（kasugamycin），又名春日霉素、加收米、加瑞農(nóng)等，是一種農(nóng)用抗生素類(lèi)殺菌劑，具有極強(qiáng)的內(nèi)吸滲透性，對(duì)真菌和細(xì)菌都有很好的預(yù)防和治療效果。自研發(fā)以來(lái)，其在亞洲和南美洲就被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，對(duì)水稻稻瘟病、番茄葉霉病、馬鈴薯環(huán)腐病、黃瓜和西瓜細(xì)菌性角斑病等具有很好的防治效果。春雷霉素對(duì)人畜無(wú)毒、低殘留、無(wú)污染，符合現(xiàn)代化環(huán)保要求[1]，是目前應(yīng)用較為普遍的一種理想殺菌劑。

目前，國(guó)內(nèi)的農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》對(duì)春雷霉素的殘留限量有了明確的規(guī)定。該標(biāo)準(zhǔn)已于2020年2月正式生效，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定春雷霉素在番茄中的最大臨時(shí)限量為0.05 mg/kg[2]。春雷霉素為易溶于水的強(qiáng)極性物質(zhì)，在液相色譜上保留時(shí)間較短，使得對(duì)其的分離和分析有一定難度[3]。目前春雷霉素的檢測(cè)方法尚沒(méi)有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)文獻(xiàn)也較少[4-6]，有關(guān)番茄中春雷霉素的殘留檢測(cè)方法也很少。筆者通過(guò)優(yōu)化色譜、質(zhì)譜條件，建立了用固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定番茄中春雷霉素的方法，供相關(guān)人員測(cè)定番茄中春雷霉素殘留時(shí)做參考。

1 實(shí)驗(yàn)器材與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀、HILIC色譜柱（150 mm×3.0 mm），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；BH600分析天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；攪拌機(jī)，飛利浦（中國(guó)）投資有限公司；SF-DL-4M冷凍離心機(jī)，上海菲恰爾分析儀器有限公司；SK3300HP超聲波提取儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；DC-12H氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；渦旋混合器，上海醫(yī)大儀器有限公司；FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；57044固相萃取儀，美國(guó)色譜科公司。

1.1.2 試劑和耗材

超純水，美國(guó)密里博公司；乙腈（色譜級(jí)）、甲醇（色譜級(jí)）、甲酸（色譜級(jí)），美國(guó)ACS恩科化學(xué)有限公司；氨水（分析純），上海國(guó)藥集團(tuán)；PCX混合陽(yáng)離子交換固相萃取柱（60 mg/3 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；高純度氮?dú)猓兌?9%）、高純度氬氣（純度99%），上海液化空氣集團(tuán)。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

春雷霉素鹽酸鹽（kasugamycin hydrochloride），CAS為19408-46-9，分子式為C14H26ClN3O9，分子量為415.824。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自Dr.E.公司。

1.1.4 試劑的配置

①10%氨水-甲醇溶液：移取10 mL氨水用甲醇定容至100 mL；②0.1%甲酸-水溶液：移取1 mL甲酸用水定容至1 000 mL。

1.1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

①標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 000 mg/L）：精確稱(chēng)取10.95 mg春雷霉素鹽酸鹽（折算后含純品春雷霉素10 mg）標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10 mL，使其標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中春雷霉素的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。置于1～4℃冰箱保存，可保存12個(gè)月。②標(biāo)準(zhǔn)中間液（10.00 mg/L）：準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL用水定容至10 mL，混勻。置于1～4℃冰箱保存，可保存1個(gè)月。

1.2 試樣的制備與保存

抽取番茄樣品，先用攪拌機(jī)攪碎，再用高速分散均質(zhì)器以15 000 r/min轉(zhuǎn)速進(jìn)一步勻漿至糊狀，于4℃保存，待測(cè)。

1.3 試樣的前處理

1.3.1 提取

稱(chēng)取均質(zhì)后試樣2.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL水，渦旋均勻，超聲15 min，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，用水定容至20 mL。

1.3.2 凈化

取10 mL提取液過(guò)用6 mL甲醇、6 mL水活化好的PCX混合陰離子交換固相萃取柱。隨后用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，抽干。用10%氨水-甲醇9 mL洗脫：用甲醇定容至10 mL；取2 mL氮吹去除氨水，至約0.5 mL；用50%甲醇水溶液定容至2 mL，過(guò)膜后上機(jī)進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。

1.4 儀器條件

①液相條件。色譜柱：HILIC柱（150 mm×3.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈，流動(dòng)相梯度見(jiàn)表1；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 流動(dòng)相梯度

②質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧ESI離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：SRM；電噴霧電壓：3 500 V；鞘氣：高純氮?dú)猓? psi；輔助氣：高純氬氣，5 psi。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的確定

春雷霉素在C18液相色譜柱上沒(méi)有保留，本方法采用HILIC柱進(jìn)行色譜分析。采用乙腈和0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

在全掃描方式下，配置一定濃度標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品直接注入質(zhì)譜來(lái)優(yōu)化質(zhì)譜條件，找到最強(qiáng)的+H離子峰作為母離子，對(duì)選定的母離子進(jìn)行掃描，優(yōu)化碰撞能，選擇其中響應(yīng)和峰型較好的2對(duì)離子對(duì)作為定量離子（380.2/112.0）和定性離子（380.2/336.1）。碰撞能量（V）為17/5，傳輸透鏡補(bǔ)償電壓為74 V。春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式離子掃描譜見(jiàn)圖1。

圖1 春雷霉素的標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式離子描譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

為消除LC-MS/MS的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響，筆者以空白番茄提取液作為溶劑配置并繪制春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)工作曲線，質(zhì)量濃度點(diǎn)分別為5、10、20、50、100 μg/L，利用MRM離子掃描方法進(jìn)行檢測(cè)，得到春雷霉素標(biāo)曲線的回歸方程，線相關(guān)系數(shù)為0.999 7，在5～100 μg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，適合做定量分析。春雷霉素的基質(zhì)工作曲線見(jiàn)圖2。

圖2 春雷霉素的基質(zhì)工作曲線

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按照已建立的方法，以番茄為空白，按照0.05、0.10、0.20 mg/kg的加標(biāo)量對(duì)春雷霉素進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行7次平行試驗(yàn)，檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度和精密度?；厥章蕿?5.25%～85.74%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.51%～3.80%。各組分的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表2。春雷霉素樣品加標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式離子掃描譜圖見(jiàn)圖3。

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用所建立的方法分析了從上海某市場(chǎng)及超市中采集的番茄樣品中的春雷霉素，在少數(shù)的番茄樣品中檢測(cè)到微量春雷霉素殘留，但未達(dá)到方法檢出限。圖4是某市場(chǎng)采集的番茄樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式正離子掃描譜圖。

表2 春雷霉素的加標(biāo)量、加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖3 春雷霉素的樣品加標(biāo)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式正離子掃描譜圖

圖4 實(shí)際樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式正離子掃描譜圖

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用水溶液為提取溶劑，將固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合，建立了測(cè)定番茄中春雷霉素殘留量的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)單、快速，靈敏度，準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，污染小，檢出限能夠滿足相關(guān)殘留限值的要求。利用該方法能夠?qū)崿F(xiàn)番茄中春雷霉素殘留量的檢測(cè)。