利用廢棄含鉻革屑制備工業(yè)蛋白粉的工藝探究

丁凡，紀翔輝，段寶榮，王全杰,2★

（1.煙臺大學化學化工學院，山東 煙臺264005；2.國家制革技術研究推廣中心，山東 煙臺264005）

改革開放以來，皮革行業(yè)快速發(fā)展，在制革過程中只有60%左右的原料皮能夠轉化為皮革產(chǎn)品，其余的則成為固體廢棄物[1]。這些固體廢棄物的主要成分為鉻和膠原蛋白，將其中的鉻鹽脫除并提取出膠原蛋白，是目前研究的主要思路[2-4]。膠原蛋白由于具有良好的絮凝性、保濕性、發(fā)泡性、粘合性、表面張力以及金屬離子鰲合性能等，在水處理、紡織業(yè)、建材、膠粘劑、制革業(yè)、造紙業(yè)以及農業(yè)等工業(yè)領域中均得到了廣泛使用[5-7]。

當使用酸法處理含鉻革屑時，高濃度的H+與膠原羧基具有很強的結合能力，能夠與Cr3+發(fā)生爭奪作用，使得配合物的水解平衡向著解聚的方向進行，且酸性條件能夠破壞分子間的鹽鍵和席夫堿，進而使膠原纖維發(fā)生溶脹，有利于釋放出膠原蛋白[8,9]，但酸溶液會對設備造成一定的腐蝕，且產(chǎn)物中Cr3+處于溶解狀態(tài)，很難與膠原蛋白徹底分離，因此一般不單獨使用[10]。在堿性溶液中存在著大量的OH-，它具有比膠原羧基更強地與Cr3+發(fā)生配位的能力，從而取代膠原羧基與Cr3+反應生成Cr(OH)3沉淀，經(jīng)過濾將其去除，堿法是目前處理含鉻廢棄物最常用的方法[11]。

本研究采用酸法預浸泡、堿法水解的方式處理含鉻革屑，將得到的水解液經(jīng)噴霧干燥制備成膠原蛋白粉，以產(chǎn)物中水分含量、灰分含量、氮含量以及含鉻量為指標，探究符合工業(yè)使用要求蛋白粉的最佳制備工藝。

1 實驗部分

1.1 主要實驗材料及儀器

實驗材料：含鉻革屑，工業(yè)品，煙臺文登制革廠；氫氧化鈉，分析純，天津永大化學試劑有限公司；氧化鈣，分析純，天津致遠化學試劑有限公司；硫酸，分析純，煙臺三和化學試劑有限公司；硫酸鉀，分析純，天津登科化學試劑有限公司；硫酸銅，分析純，天津登科化學試劑有限公司；無水乙醇，分析純，天津永大化學試劑有限公司；鄰苯二甲醛，分析純，上海源葉生物科技有限公司；四硼酸鈉，分析純，天津風船化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉，分析純，上海麥克林生化科技有限公司；二硫蘇糖醇，分析純，北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；溴甲酚綠，分析純，天津北辰方正試劑廠；甲基紅，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗儀器：AR2140 型電子天平，常熟雙杰測試儀器廠；DHG-9073 型電熱恒溫鼓風干燥箱，龍口市先進儀器有限公司；HH-DR1 型電熱恒溫油浴鍋，上海雙捷實驗設備有限公司；JJ-1 型電動增力攪拌器，龍口市先進儀器有限公司；NDJ-5S 型循環(huán)水多用真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；RE52CS 型旋轉蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；0-90%Brix（糖）型手持糖度計，上海力辰邦西儀器有限公司；L-6000Y 型噴霧干燥機，上海皓莊儀器有限公司；K1305A 型自動定氮儀，上海晟生分析儀器有限公司；JH752 型紫外-可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；TYPE SPT12 型消解爐，北京三品科創(chuàng)儀器有限公司；SX2-4-10 型箱式電阻爐，龍口市先進儀器有限公司；AA-6880 型原子吸收分光光度計，島津(上海)實驗器材有限公司；pHS-3D 型功能性pH 計，上海三信儀表廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 噴霧干燥機的工作參數(shù)

本文使用噴霧干燥法對液態(tài)膠原蛋白進行干燥，噴霧干燥機的具體工作參數(shù)見表1。

表1 噴霧干燥機的工作參數(shù)Tab.1 Working parameters of spray dryer

1.2.2 膠原蛋白粉的工業(yè)標準

本文中膠原蛋白粉的蛋白質含量、水分含量、灰分含量標準參照SB/T 10634-2011《淡水魚膠原蛋白肽粉》中的規(guī)定，含鉻量以GB 13078-2017《飼料衛(wèi)生標準》中規(guī)定的數(shù)值作為參考。具體標準數(shù)值見表2。

表2 膠原蛋白粉的質量標準Tab.2 Quality standards of collagen powder

1.2.3 堿水解條件的工藝優(yōu)化（所有試劑的加入量均按絕干革屑質量計）

1.2.3.1 水解時間的單因素實驗

根據(jù)丁凡等[12]的研究，選用復合比(%∶%)5∶3的CaO 與NaOH 作為水解用堿，固定水解溫度為90℃、液固比為6，設置水解時間分別為4 h、6 h、8 h、10 h、12 h，水解完成后對水解液進行過濾，使用濃硫酸中和至pH 值處于6～7 之間，靜置1 h 后再次過濾，收集濾液進行旋轉蒸發(fā)濃縮至糖度約為20°Brix，將水解液進行噴霧干燥制備成膠原蛋白粉，并對蛋白粉中水分含量、灰分含量、氮含量以及含鉻量進行檢測。

1.2.3.2 水解溫度的單因素實驗

在最佳水解時間下，固定液固比為6，依次改變水解溫度為75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，其余操作步驟參照1.2.3.1 進行。

1.2.3.3 水解液固比的單因素實驗

固定最佳水解時間和最佳水解溫度，改變水解液固比（g∶g）分別為5、6、7、8、9，其余操作步驟參照1.2.3.1 進行。

1.2.3.4 正交實驗

在單因素實驗的基礎上，以膠原蛋白粉中灰分含量為指標，對水解溫度、水解時間、水解液固比這三個因素進行正交實驗，探究最低灰分膠原蛋白粉的堿法制備工藝。

1.2.4 酸浸泡條件優(yōu)化（所有試劑的加入量均按絕干革屑質量計）

1.2.4.1 硫酸加入量的探究

準確稱取40 g 絕干革屑，放入塑料容器中，向其中加入600 mL 水，依次改變濃硫酸加入量為5%、10%、15%、20%、25%，攪拌均勻，浸泡10 h 后瀝干，使用悶水洗至pH 值為6 左右，再次瀝水擰干后置于500 mL 三口燒瓶中，在1.2.3 步得出的最低灰分堿水解工藝下水解制備膠原蛋白粉，并進行灰分含量及含鉻量的測定。

1.2.4.2 硫酸浸泡時間的探究

固定最佳硫酸加入量，改變浸泡時間依次為12h、24 h、36 h、48 h、60 h，其余步驟參照1.2.4.1，對在最佳條件下制備出的膠原蛋白粉各項指標進行檢測。

1.2.5 水分含量的測定：采用直接干燥法[13]

取一定量蛋白粉放入一只干燥潔凈的250 mL燒杯中，稱量蛋白粉與燒杯的質量，將其置于120℃恒溫干燥箱中烘干2 h 后，置于干燥器內冷卻0.5 h，稱量，反復干燥至恒重，得到烘干后蛋白粉和燒杯的質量。按公式（1）計算蛋白粉中的水分含量：

式中：

W——蛋白粉水分含量，%；

m0——燒杯質量，g；

m1——烘干前蛋白粉與燒杯質量，g；

m2——烘干后蛋白粉與燒杯質量，g。

1.2.6 灰分含量的測定：灼燒法[14]

稱取一定量烘干后的蛋白粉，置于已經(jīng)洗凈并烘干的瓷坩堝中，放入馬弗爐中后，設置升溫程序使溫度逐漸升高至580℃，繼續(xù)灼燒2 h 后取出，置于干燥器內冷卻0.5 h，取出稱量。蛋白粉中灰分含量的計算見公式（2）：

式中：

A——灰分含量，%；

x1——蛋白粉質量，g；

x2——灼燒后灰分和坩堝質量，g；

x3——坩堝質量，g。

1.2.7 含鉻量的測定：石墨爐原子吸收法[15]

準確稱取0.1 g 烘干后的蛋白粉置于消化管中，再向其中加入5 mL 濃硫酸，在管口處放置彎頸小漏斗，并將整個體系置于消解爐上，設置消解溫度為250℃，當溫度升到250℃時保持10 min 后取下，稍加冷卻后滴加2 mL 雙氧水，仍在250℃下消解10 min，重復此操作，直至消解管內液體澄清透明，繼續(xù)加熱10 min 后取下消解管，將管內液體全部倒入100 mL 容量瓶中，使用蒸餾水定容至刻度，將其倒入石墨爐原子吸收分光光度計的樣品管內，進行含鉻量的測定。

1.2.8 氮含量的測定：凱氏定氮法[16]

稱取一定量蛋白粉置于消解管中，加入5 mL 濃硫酸、0.3 g 硫酸鉀、5 滴飽和硫酸銅，輕晃搖勻后覆上彎頸漏斗，置于消解爐上，設置程序為每隔30 min進行一次升溫（120℃、250℃、380℃、420℃），在420℃下保持60 min。消解結束后，待冷卻至室溫，將消解管及一只干凈的250 mL 錐形瓶安裝在定氮儀上，定氮儀的設定參數(shù)為：酸液30 mL、堿液40 mL、時間為5 min，蒸餾完成后向錐形瓶中滴加5 滴溴甲酚綠-甲基紅指示劑，使用濃度為0.1 mol/L 的鹽酸進行滴定，滴定終點為液體由淡藍色變?yōu)闇\紫色。含氮量的計算如公式（3）：

式中:

ω ——含氮量，%；

c——標準鹽酸溶液的濃度，0.1 mol/L；

v1——滴定管初始刻度，mL；

v2——滴定管最終刻度，mL；

m——蛋白粉的質量，g。

1.2.9 粗蛋白含量的計算

根據(jù)氮含量的具體數(shù)值，可以由經(jīng)驗公式（4），計算出產(chǎn)物中的粗蛋白含量。

式中：

P1——氮含量，%；

P2——粗蛋白含量，%。

1.2.10 游離氨基含量的測定

游離氨基含量的檢測方法有很多，其中OPA 法相較于其他方法具有操作簡單快速、檢測結果精確等優(yōu)勢[17]，其原理是：游離氨基可以與鄰苯二甲醛（OPA）反應形成一種黃色的絡合物，使用分光光度計能夠在特定波長下檢測其吸光度[18]。本實驗參照羅艷華等[16]的方法進行蛋白粉中游離氨基含量的檢測。

2 結果與討論

2.1 水解條件的優(yōu)化

2.1.1 水解時間

圖1 水解時間對蛋白粉品質的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the quality of protein powder

圖1 反映了水解時間的變化對蛋白粉各項指標的影響?？梢钥闯?，固定水解溫度為90℃、液固比為6 的條件下，隨著水解時間的延長，蛋白粉中氮含量基本穩(wěn)定在14%左右的水平，在8 h 出現(xiàn)了灰分含量的最低值以及含鉻量快速下降的拐點。在鉻革屑中除了含有膠原蛋白和鉻，還包含在制革加工過程中引入的一些NaCl、Na2SO4等無機鹽，隨著水解時間的增長，一部分無機鹽會溶解在水解液中，進而過長的水解時間會導致產(chǎn)物中灰分含量增多。綜合考慮，選取8 h 為最優(yōu)水解時間，此時蛋白粉產(chǎn)率為54.70%、水分含量為3.50%、灰分含量為6.67%、氮含量為14.40%、含鉻量為120 mg/kg。

2.1.2 水解溫度

圖2 水解溫度對蛋白粉品質的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on the quality of protein powder

從圖2 中可以看出，固定水解時間為8 h、液固比為6 的條件下，隨著水解溫度的升高，蛋白粉中氮含量基本保持在穩(wěn)定水平，產(chǎn)率在90℃時出現(xiàn)最大值，含鉻量在85℃之后下降趨勢放緩，灰分含量在85℃時降至最低，超過此溫度后灰分含量開始增大。由于水解用堿中包含CaO，在水中能夠釋放出部分Ca2+，而在水解升溫的過程中膠原蛋白不斷被降解，釋放出大量—COOH 官能團，它能夠與Ca2+發(fā)生配位反應，生成鈣鹽，因此過高的溫度會導致產(chǎn)物中灰分含量增大。綜合考慮，選取85℃為最佳水解溫度，此時蛋白粉產(chǎn)率為42%、水分含量為4.70%、灰分含量為5.78%、氮含量為14.38%、含鉻量為125.31 mg/kg。

2.1.3 液固比

圖3 反映了在固定水解時間8 h、水解溫度為85℃的條件下，水解液固比的變化對蛋白粉品質產(chǎn)生的影響。從圖中可以看出，隨著液固比增大，蛋白粉的產(chǎn)率始終保持在43%以上，氮含量處在13.06%～14.55%的范圍內，含鉻量在液固比處于5～7 之間時有明顯下降，之后略微上升，灰分含量在液固比為7 時降至最小值。當液固比過小時，鉻革屑無法與堿液充分接觸，使得部分鉻革屑未能被水解，導致水解反應不完全，因此在一定范圍內隨著液固比增大，蛋白粉產(chǎn)品的含鉻量快速下降；而當液固比過大時，水解體系中水分濃度過高，使得堿液被稀釋，從而降低了水解力度，因此在液固比超過一定值后，蛋白粉灰分含量及含鉻量均有所上升。綜上，選擇最佳水解液固比為7，此時蛋白粉產(chǎn)率為48.60%、水分含量為5.20%、灰分含量為5.69%、氮含量為14.52%、含鉻量為57.30 mg/kg。

2.1.4 正交實驗優(yōu)化

以灰分含量為指標，對水解時間、水解溫度及水解液固比這三個因素進行了正交實驗，結果見表3。

圖3 液固比對蛋白粉品質的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the quality of protein powder

表3 正交試驗結果分析表Tab.3 Analysis table of orthogonal test results

由正交試驗結果可以看出，以灰分含量為指標，各影響因素的主次關系為：水解溫度＞水解時間＞液固比，最佳參數(shù)組合為：水解時間10 h、水解溫度為95℃、液固比為6，在此條件下進行三次重復試驗，得到蛋白粉灰分含量的平均值為5.42%，同時對此工藝下制備出蛋白粉的含鉻量進行了檢測，其數(shù)值為52.31mg/kg。此時的含鉻量超出表2 中所列標準的最大值，且灰分含量雖在標準范圍內，但仍處于較高水平。

2.2 硫酸預處理對蛋白粉品質的影響

為了進一步降低蛋白粉含鉻量及灰分含量，采取了硫酸浸泡的方式對鉻革屑進行預處理。

2.2.1 酸加量

圖4 H2SO4 加入量對含鉻量和灰分含量的影響Fig.4 Effect of H2SO4 addition on chromium content and ash content

圖4 反映了在使用濃硫酸對鉻革屑進行水解前預處理時，H2SO4加入量對蛋白粉含鉻量及灰分含量的影響?？梢钥闯龉潭ń輹r間為10 h，隨著H2SO4加入量的增加，含鉻量不斷降低，在加入量超過15%后，變化趨于平緩，且蛋白粉中灰分含量的變化幅度也在此時減弱。因此，選取15%為預處理時H2SO4的最優(yōu)加入量，此時含鉻量為20.11 mg/kg，灰分含量為5.23%。

2.2.2 預處理時間

圖5 顯示的是在固定H2SO4加入量為15%時，通過改變預處理時間對蛋白粉含鉻量及灰分含量的影響。從圖中可以看出，隨著時間的延長含鉻量和灰分含量均呈不斷下降的趨勢，灰分含量的整體下降趨勢相對平緩，含鉻量在12 h～24 h 內發(fā)生了較為明顯的下降，之后波動幅度較小?；跁r間成本考慮，選取24 h 為最佳預處理時間，此時產(chǎn)品中含鉻量為16 mg/kg，灰分含量為4.59%，且二者數(shù)值均優(yōu)于表2 中列出的標準。

圖5 H2SO4 浸泡時間對含鉻量和灰分含量的影響Fig.5 Effect of immersion time of H2SO4 on chromium content and ash content

2.3 膠原蛋白粉各項理化指標

表4 膠原蛋白粉各項理化指標Tab.4 Physical and chemical indexes of collagen powder

3 結 論

本實驗選用CaO 與NaOH 作為水解用堿，在固定二者的使用比為5∶3（%∶%）的條件下，分別探究了水解時間、水解溫度、水解液固比對蛋白粉中水分含量、灰分含量、氮含量以及含鉻量的影響，并通過以灰分含量為指標的正交試驗找到了低灰分膠原蛋白粉的堿法制備工藝。同時，為了進一步降低蛋白粉產(chǎn)品中的灰分含量及含鉻量，使用濃硫酸對鉻革屑進行水解前預浸泡，確定了最佳硫酸預處理條件。得出了以下結論：

（1）在水解溫度為95℃、液固比為6、水解時間10 h 的條件下處理含鉻革屑，制得的蛋白粉灰分含量為5.42%、含鉻量為52.31 mg/kg，此時蛋白粉中灰分含量達到工業(yè)使用標準但含鉻量過高。

（2）使用加入量為15%的濃H2SO4預浸泡24 h后，再在最佳堿水解工藝下處理含鉻革屑，得到蛋白粉產(chǎn)品的水分含量為4.60%、灰分含量為4.59%、粗蛋白含量為89.38%、含鉻量為16 mg/kg，此時灰分含量以及含鉻量均低于單純使用堿水解時制得的產(chǎn)物，因此可以確定鉻革屑在堿水解前先使用硫酸預處理，能夠有效提升制備出的蛋白粉品質，且各項指標均達到標準，可以在工業(yè)中使用。