復(fù)方黃連油涂劑無菌檢查方法適用性研究

鄢雷娜，王繹，陳希，劉衛(wèi)德，儲(chǔ)梅君，劉緒平*

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，南昌 330029；2.國(guó)科健康控股（江西）有限公司，南昌 330029

復(fù)方黃連油涂劑是由黃連、地榆、黃柏、黃岺、生大黃、虎杖、冰片和麻油香精組成，具有清熱消腫，止痛解毒，排膿祛腐，消炎生肌等功效。用于Ⅰ-Ⅲ度燒燙傷，以及壓瘡、糖尿病足等局部皮膚潰瘍的治療。按照《中國(guó)藥典》2015 版四部通則［1］涂劑項(xiàng)下規(guī)定，應(yīng)對(duì)該品種進(jìn)行無菌檢查。該品種處方中麻油為油性基質(zhì)，在樣品前處理時(shí)，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行充分的乳化后再進(jìn)行無菌檢查。中藥外用涂劑的無菌及微生物限度檢查報(bào)道都相對(duì)偏少，大多數(shù)的報(bào)道還是停留在按照《中國(guó)藥典》2005 年版和2010 年版建立的無菌和微生物方法的階段。本文通過參考相關(guān)文獻(xiàn)資料和《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則1101［1］，采用薄膜過濾法對(duì)復(fù)方黃連油涂劑進(jìn)行無菌方法適用性試驗(yàn)，為該制劑的檢驗(yàn)與研發(fā)提供有效可靠的參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HTY-2000A 集菌儀（杭州高德泰林有限公司）；ACB-6A1 型垂直流超凈工作臺(tái)（新加坡ESCO 公司）；Heal Force900C 型生物安全柜（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；LDZX-40B 高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；PYX-DHS 型細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；KB400 霉菌培養(yǎng)箱（德國(guó)BINDER 公司）；EVS2 全封閉無菌檢驗(yàn)過濾培養(yǎng)器（浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 菌種

菌種均源自中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心，試驗(yàn)所用菌株均為第2 代，具體信息詳見表1。

表1 菌種信息表

（續(xù)表）

1.3 培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基及試劑均經(jīng)過適用性試驗(yàn)驗(yàn)證，符合《中國(guó)藥典》2015 年版［1］的要求。培養(yǎng)基具體信息見表2。

表2 培養(yǎng)基信息表

1.4 樣品

復(fù)方黃連油涂劑（生產(chǎn)單位：江西本草天工科技有限責(zé)任公司；規(guī)格：每瓶100 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 無菌檢查方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)

2.1.1 菌液的制備根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 年版四部通則1101“無菌檢查法”項(xiàng)下方法的規(guī)定［1］，制得每1 mL 含菌數(shù)分別不大于100 cfu 的大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽胞桿菌、黑曲霉菌懸液，并對(duì)所制備的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，結(jié)果見表3。

表3 菌液計(jì)數(shù)結(jié)果 CFU/mL

2.1.2 供試液制備按批出廠檢驗(yàn)量取本品10 瓶，每瓶取20 mL，置滅菌鹽水瓶中，加入42 ℃無菌十四烷酸異丙酯50 mL，振搖使其充分溶解，再加入0.1%無菌蛋白胨水溶液200 mL，充分振搖，靜置，取下層水相作為供試液。

2.2 方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 供試液的制備該試驗(yàn)中每支EVS2 型集菌培養(yǎng)器先用約0.1%無菌蛋白胨水溶液50 mL 濕潤(rùn)后，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，再將制備好的供試液全部抽入EVS2 型薄膜過濾器內(nèi)過濾；然后用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），然后濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基濾入EVS2 型集菌培養(yǎng)器，加入少于100 cfu/mL 的試驗(yàn)菌（大腸埃希菌、生孢梭菌、金黃色葡萄球菌：硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基；白色念珠菌、枯草芽胞桿菌、黑曲霉：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基），置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察結(jié)果。

2.2.2 陽性對(duì)照陽性對(duì)照組每支EVS2 型薄膜過濾器先用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液潤(rùn)濕，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，再用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），再分別加入各試驗(yàn)菌懸液1 mL，過濾。然后濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基濾入EVS2 型集菌培養(yǎng)器。

2.2.3 陰性對(duì)照陰性對(duì)照組中兩支EVS2 型薄膜過濾器分別先用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液潤(rùn)濕，使0.1%無菌蛋白胨水溶液順利流出，再用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），然后濾干并將硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基濾入EVS2 型集菌培養(yǎng)器。

2.2.3 培養(yǎng)條件裝有TSB 的集菌器置于23 ℃培養(yǎng)14 d，裝有硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的集菌器置于33 ℃培養(yǎng)14 d，逐日觀察，記錄陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組與試驗(yàn)組6 組試驗(yàn)菌株的生長(zhǎng)情況。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

通過驗(yàn)證試驗(yàn)表明，本品采用薄膜過濾法過濾，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗（每張濾膜不少于500 mL，100 mL/次），6 組試驗(yàn)菌株陽性對(duì)照組與試驗(yàn)組生長(zhǎng)同步無明顯差異，陰性對(duì)照組無菌生長(zhǎng)，說明該方法基本可行，結(jié)果見表4。

表4 方法驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

3.1 集菌培養(yǎng)器的選擇

復(fù)方黃連油涂劑是油性制劑，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)采用APY220 型集菌培養(yǎng)器，抽濾樣品時(shí)出現(xiàn)壓力過大或過濾速率過慢，長(zhǎng)時(shí)間過濾不下去等現(xiàn)象，增加了染菌的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響了結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性［2,3］。后采用EVS2 型集菌培養(yǎng)器，上述問題均得到解決，最后試驗(yàn)確定選用EVS2 型集菌培養(yǎng)器。

3.2 供試液制備方法的考察

一些口服和外用中藥制劑常含有較復(fù)雜的中藥成分，這些成分均有不同程度的抑菌作用，所以在建立中藥制劑無菌檢查和微生物限度檢查方法時(shí)需把消除樣品的抑菌性考慮進(jìn)去。本制劑含有黃連、地榆、黃柏、黃岺和生大黃等多種中藥成分，地榆中的鞣質(zhì)、生大黃中的蒽醌類和黃連中的異喹啉類生物堿均有不同程度的抑菌作用，采用薄膜過濾法，用0.1%無菌蛋白胨水溶液沖洗，每張濾膜的沖洗量為500 mL（100 mL/次），可有效避免油脂類成分和一些中藥抑菌成分吸附在過濾膜上［4-10］。

復(fù)方黃連油涂劑處方中麻油為油性基質(zhì)，需對(duì)樣品使用一定的乳化劑進(jìn)行充分的乳化后再進(jìn)行試驗(yàn)，本文采用了42 ℃無菌十四烷酸異丙酯使供試品充分溶解分散，并加入0.1%無菌蛋白胨水溶液200 mL 充分萃取，靜置后取下層水相作為供試品溶液。本文考察了供試液的制備方法，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 年版四部的取樣標(biāo)準(zhǔn)，選擇取本品10 瓶，每瓶20 mL，加入50 mL 十四烷酸異丙酯溶解，再以0.1%無菌蛋白胨水溶液200 mL 萃取，靜置后分層效果較好，且方便操作［11,12］。

4 結(jié)論

該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、方法科學(xué)，為同類油性涂劑的無菌檢查法提供了有效可靠的參考依據(jù)。