張府君,郝晶晶,藥雅俊,甄會(huì)賢
(山西藥科職業(yè)學(xué)院,山西 太原 030031)
金錢草的原植物為報(bào)春花科珍珠菜屬植物過(guò)路黃(LysimachiachristinaeHance),藥用部位為全草[1]。又名過(guò)路黃、連線草、鏡面草。全草含槲皮素、山柰素等黃酮類化合物以及無(wú)機(jī)鹽多糖等成分。具有清熱解毒,抑菌[2],抗血栓[3],散瘀消腫,抗炎[4],利濕退黃之功效,可用于熱淋,沙淋,尿澀作痛[5]等癥,因此其具有良好的藥用價(jià)值。但金錢草傳統(tǒng)藥材的使用需要進(jìn)行正確煎煮,不僅過(guò)程繁瑣,而且對(duì)煎煮器具、時(shí)間等都有要求,將藥材飲片制備成配方顆粒后可以省略自行煎煮(提取)過(guò)程,是一種使用方便、安全有效的制劑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)金錢草配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究,為金錢草配方顆粒的標(biāo)準(zhǔn)化制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。
Waters 2695高效液相色譜儀,Waters 2998檢測(cè)器,Empower色譜工作站,美國(guó)沃特世公司;AB135-S電子天平(十萬(wàn)分之一),瑞士METTLER公司;HANGPING FA2104型(萬(wàn)分之一天平),上海精科;YC-015噴霧干燥機(jī);SB-800DTD型超聲波清洗機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;硅膠G板(批號(hào):20170626),青島譜科分離材料有限公司;WD-9403C紫外儀,北京六一生物科技有限公司;RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮機(jī)器廠。
金錢草飲片(批號(hào):160901),河北智嘉藥業(yè)有限公司,經(jīng)甄會(huì)賢副教授鑒定均為《中國(guó)藥典》(2015版)收載品種;槲皮素對(duì)照品(含量測(cè)定用,批號(hào):100081-201610)、山柰素對(duì)照品(含量測(cè)定用,批號(hào):110861-201611),中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇(批號(hào):Lot No 161104290004),瑞典歐森巴克化學(xué)公司;乙腈(批號(hào):Lot No.12960217),天津賽孚瑞科技有限公司;娃哈哈純凈水。其余試劑為分析純。
稱取金錢草飲片適量,加水浸泡30 min,加熱回流提取兩次,每次1 h,第一次加水10倍,第二次加水8倍,濾出藥液,合并濾液。將濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中60 ℃減壓濃縮至相對(duì)密度為1.05~1.10,噴霧干燥(參數(shù):進(jìn)風(fēng)溫度200 ℃;出風(fēng)溫度60 ℃;進(jìn)樣流速5.0 mL/min),即得。
2.2.1 供試品溶液的制備
取金錢草配方顆粒1 g,參照文獻(xiàn)[6]制備供試品溶液。
2.1.2 對(duì)照品溶液的制備
分別稱取槲皮素、山柰素對(duì)照品適量,加80%甲醇制成每1 mL含槲皮素0.20 mg、山柰素0.10 mg的對(duì)照品溶液。
2.1.3 薄層色譜鑒別
照薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn),吸取供試品溶液20 μL,槲皮素對(duì)照品5 μL,山柰素對(duì)照品20 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上,以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10:8:1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以3%三氯化鋁乙醇溶液,在105 ℃加熱數(shù)分鐘,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)(見圖1)。
圖1 金錢草配方顆粒薄層色譜板
(1)色譜條件。色譜柱:BDS HYPERSIL C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液(60:40);流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;進(jìn)樣量:10 μL。
(2)對(duì)照品溶液的制備。取槲皮素對(duì)照品和山柰素對(duì)照品適量,加 80%甲醇制成每 1 mL各含槲皮素200 μg、山柰素100 μg的混合溶液,即得。
(3)供試品溶液的制備。取本品粉末0.5 g,精密稱定,參照文獻(xiàn)[1]制備供試品溶液。
(4)系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀測(cè)定(對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次),考察系統(tǒng)適用性,結(jié)果理論塔板數(shù)為2600(金錢草藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要求理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于2500)、重復(fù)性RSD=1.21%、分離度5.30、拖尾因子0.97、均符合要求(槲皮素、山柰素對(duì)照品、金錢草配方顆粒、金錢草飲片色譜圖見圖2~圖5)。
圖2 槲皮素對(duì)照品HPLC圖(1 槲皮素)
圖3 山柰素對(duì)照品HPLC圖(2 山柰素)
圖4 金錢草配方顆粒HPLC圖
圖5 金錢草飲片HPLC色譜圖
(5)樣品含量測(cè)定。分別精密吸取對(duì)照品溶液與3批供試品溶液各10 μL,進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見表1。
表1 含量測(cè)定結(jié)果
2.3.1 流動(dòng)相的考察
本試驗(yàn)比較了甲醇-0.1%磷酸水與乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫的方法。本試驗(yàn)對(duì)文獻(xiàn)資料的兩種流動(dòng)相進(jìn)行了考察。(1)甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(表2),結(jié)果見圖6,此色譜條件下金錢草膏出峰,但出峰效果極差,且分離效果不好。(2)乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(表3),結(jié)果見圖7,此色譜條件下供試品的色譜峰分離效果良好。故選擇表3的梯度洗脫條件,該條件下,供試品出峰,各成分達(dá)到基線分離,峰型對(duì)稱,分離效果較好。
表2 梯度洗脫條件
圖6 金錢草配方顆粒指紋圖譜(表2條件)
表3 梯度洗脫條件
圖7 金錢草配方顆粒HPLC圖(表3條件)
2.3.2 指紋圖譜的建立
色譜條件。色譜柱:BDS HYPERSIL C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動(dòng)相:乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B),梯度洗脫(表3),流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):360 nm;進(jìn)樣量:10 μL。
參照物溶液的制備。取槲皮素對(duì)照品和山柰素對(duì)照品適量,加80%甲醇制成每1 mL各含槲皮素200 μg、山柰素100 μg的混合溶液,即得。
供試品溶液的制備。同2.2.2含量測(cè)定項(xiàng)下“供試品溶液的制備”。
測(cè)定法。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液10 μL,進(jìn)樣測(cè)定,記錄60 min的色譜圖,即得。槲皮素、山柰素對(duì)照品,金錢草配方顆粒HPLC圖(見圖8~圖10)。
圖8 槲皮素參照物溶液HPLC圖
圖9 山柰素參照物溶液HPLC圖
圖10 金錢草配方顆粒HPLC指紋圖譜
薄層色譜鑒別以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10:8:1)為展開劑,得到的薄層色譜圖斑點(diǎn)顯色清晰,分離良好,金錢草配方顆粒樣品與槲皮素、山柰素對(duì)照品在相應(yīng)位置顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。含量測(cè)定試驗(yàn)中,在參考文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上,對(duì)流動(dòng)相中磷酸濃度以及甲醇、磷酸的不同比例進(jìn)行了對(duì)比,結(jié)果顯示當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液(60:40)時(shí),系統(tǒng)適用性試驗(yàn)均符合藥典規(guī)定,專屬性強(qiáng),分離度好。指紋圖譜考察了甲醇-0.1%磷酸水和乙腈-0.1%磷酸水梯度洗脫的方法,通過(guò)比較確定了用乙腈-0.1%磷酸水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,初步確定了金錢草配方顆粒的HPLC指紋圖譜測(cè)定條件。
本文的薄層色譜鑒別法、含量測(cè)定和指紋圖譜建立的測(cè)定方法簡(jiǎn)便可行、準(zhǔn)確、快速,樣品處理及色譜條件簡(jiǎn)單,方法可靠??捎糜诮疱X草配方顆粒的制備,為后期的制劑工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考。