六株紅酵母抗氧化活性的研究

王悅 歐陽丹 湯偉，2 劉仕博 顧燕 何增國，2，3

（1. 中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，青島 266000；2. 青島海洋生物醫(yī)藥研究院，青島 266000；3. 青島百奧安泰生物科技有限公司，青島 266000）

紅酵母廣泛分布在海洋和陸地環(huán)境中［1］，能夠耐受重金屬、氧化、輻射及其他極端環(huán)境，具有營養(yǎng)豐富、發(fā)酵周期短、可高密度發(fā)酵［2］等特點。諸多研究表明紅酵母含有大量的營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖和維生素E等營養(yǎng)因子，紅酵母紅素、蛋-胡蘿卜素、番茄紅素、蝦青素、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）等活性物質(zhì)［3］。它們在抗氧化清除自由基［4］、抗腫瘤［5-6］及提高免疫力［7］等方面均有很好的效果。由于紅酵母可以天然合成類胡蘿卜素［8］，安全風(fēng)險低，因此人們對能產(chǎn)生類胡蘿卜素的紅酵母興趣在逐年增加［9］。據(jù)統(tǒng)計，全球類胡蘿卜素市場呈不斷增長趨勢，2017年全球類胡蘿卜素市場總銷售額達到15億美元，預(yù)計2017-2022年復(fù)合年增長率（CAGR）為5.7%，到2022年將達到20億美元［10］。

迄今為止，紅酵母的研究多集中于菌株篩選、培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件優(yōu)化、類胡蘿卜素分離鑒定等方面［11-15］；利用誘變技術(shù)、代謝工程和基因工程等方法提高類胡蘿卜素產(chǎn)量的研究也在逐年增加［16-19］。然而有關(guān)紅酵母抗氧化性能的研究并不是很多，針對紅酵母不同組分的抗氧化性能研究更是少見。曾有研究發(fā)現(xiàn)重金屬［20］和紫外輻射等［21］極端條件提高了紅酵母的抗氧化性能，也有添加適量的紅酵母有效改善幼參的消化酶和免疫活性以及提高尼羅羅非魚的生長性能、消化酶及免疫酶活性的報道［22-23］。紅酵母作為天然的微生態(tài)抗氧化劑，在其他水產(chǎn)養(yǎng)殖品種中的應(yīng)用也初現(xiàn)端倪［24］。為更好地服務(wù)水產(chǎn)養(yǎng)殖，需要進一步挖掘紅酵母的應(yīng)用潛力，深入系統(tǒng)地探究紅酵母抗氧化功能及功效已十分必要。因此，本研究先測定了6株紅酵母的類胡蘿卜素含量及過氧化氫耐受性來初步分析其潛在的抗氧化能力，又通過測定6株紅酵母的3種組分的還原力、自由基清除能力、總抗氧化活性及超氧化物歧化酶活性來綜合分析紅酵母的抗氧化活性，旨在為開發(fā)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的天然抗氧化劑提供菌株資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基 紅酵母菌株LW1-LW6分別分離自海藻、海水、牡蠣、五彩蘇、過山蕨和桃子，并于本實驗室保存。

YPD液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，蒸餾水1 000 mL，自然pH，1×105Pa 滅菌20 min。

1.1.2 主要試劑和儀器 三氯乙酸（TCA）、30%過氧化氫、鐵氰化鉀、水楊酸、抗壞血酸、二甲亞砜（DMSO），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；二苯代苦味肼基自由基（DPPH·），源葉生物科技有限公司；總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒、BCA法微量蛋白檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

全波長酶標(biāo)儀，美國BioTek公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；THZ-C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；J-25型高速冷凍離心機，美國BECKMAN公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺，蘇州凈化；GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 將6株紅酵母菌按2%接種量接種于YPD液體培養(yǎng)基中28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)16 h，充分活化后按2%接種量轉(zhuǎn)接至YPD液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 紅酵母形態(tài)學(xué)及26S rRNA分子生物學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》［25］和《真菌鑒定手冊》［26］。

分子學(xué)鑒定參照Li等［27］方法，PCR擴增引物（NL1、NL4）由上海生工設(shè)計：NL1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，NL4：5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'。

1.2.3 總類胡蘿卜素含量的測定 有機溶劑破壁：將紅酵母發(fā)酵液在常溫下，4 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗滌兩次，留菌體，在50℃烘箱中進行烘干，得到干菌體。取干菌體0.1 g，加蒸餾水溶脹后4 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入5 mL DMSO，室溫下破壁1 h，4 000 r/min離心10 min，收集上清。破壁提取2-3次，合并上清，得到色素提取物［28-29］。

總類胡蘿卜素測定：參照王歲樓［30］的方法，色素提取物在478 nm有最大吸收峰，提取物中總類胡蘿卜素含量按以下公式計算：總類胡蘿卜素含量（μg/g）=（A478×V）/（0.16×W）式中，A478：待測樣品在478 nm處的吸光值；V：加入的溶劑體積（mL）；0.16：吸光系數(shù)；W：菌體干重（g）。

1.2.4 樣品制備 發(fā)酵上清液、完整細胞和色素提取物的制備：取發(fā)酵48 h的紅酵母菌液，4 000 r/min離心15 min，即可獲得的發(fā)酵上清液。離心后的菌體沉淀用蒸餾水洗滌3次，并且調(diào)節(jié)膠紅酵母細胞濃度為1.0×108CFU/mL，此為完整細胞。將菌體烘干，用DMSO進行色素提取，最終得到色素提取物［29］。

1.2.5 H2O2耐受性的研究 將活化好的菌液按2%接種量分別接種于含有不同濃度H2O2（終濃度為0、1、3、5、7、9、11 mmol/L）的YPD液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后，取100 μL菌液稀釋涂布于YPD固體培養(yǎng)基上，在28℃恒溫箱倒置培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)。以不添加H2O2的處理為對照組，同樣條件下計數(shù)，以對照組菌活數(shù)定義為100%。

1.2.6 抗氧化活性的測定 采用化學(xué)法測定6株紅酵母3種組分的還原力、DPPH·和·OH的清除能力，以及T-AOC和SOD活性，以此來評估3種組分的體外抗氧化能力。還原力的測定參照Ma等［31］的方法；DPPH·清除力的測定參照李慧翔等［32］和Lin等［33］的方法；·OH清除力的測定參照Gutteridge等［34-35］的方法；T-AOC和SOD活性的測定參照南京建成試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

6株紅酵母在YPD固體培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)3-4 d，菌落直徑約3-5 mm，橘紅色，菌落呈典型的酵母形態(tài)（圖1）。

對6株紅酵母進行26S rRNA分子生物學(xué)鑒定，鑒定結(jié)果為5株膠紅酵母和1株鎖擲孢酵母（表1）。

2.2 總類胡蘿卜素含量

6株紅酵母總類胡蘿卜素含量存在顯著性差異（P<0.05），但總類胡蘿卜素含量高低與菌株來源無對應(yīng)關(guān)系（表2）。其中從五彩蘇中篩選出的LW4總類胡蘿卜素含量較高，達到162.91 μg/g，與其他菌株存在極顯著性差異（P<0.01），總類胡蘿卜素含量最低的是從桃子中篩選得到的鎖擲孢酵母，其含量為117.78 μg/g。本研究中，紅酵母屬（Rhodotorula）的總類胡蘿卜素含量要極顯著高于鎖擲孢酵母屬（Sporidiobolus）。

圖1 六株紅酵母菌落形態(tài)

表1 六株紅酵母分子鑒定結(jié)果

表2 六株紅酵母的總類胡蘿卜素含量

2.3 菌株的H2O2耐受性

如圖2所示，1、3、5 mmol/L H2O2對于菌株的生長均有一定程度的促進作用。當(dāng)H2O2濃度大于5 mmol/L時，部分菌株相對存活率開始降低，H2O2濃度過高會對紅酵母生長有抑制作用。其中LW3的H2O2耐受性最強，在11 mmol/L H2O2添加量時仍有55.33%的存活率；其次是LW2和LW6，相對存活率分別為35.94%和31.51%；而LW1、LW5在11 mmol/L添加量時相對存活率為0。6株菌中耐受性最低的LW4，在9 mmol/L H2O2時菌體全部死亡。

圖2 不同濃度H2O2對紅酵母生長的影響

2.4 紅酵母抗氧化活性

2.4.1 還原力 樣品在700 nm的吸光值（圖3），6株紅酵母的3種組分均具有還原力，且存在顯著性差異（P<0.05），并呈現(xiàn)一定趨勢，6株紅酵母3種組分的還原力大小依次為發(fā)酵上清液>色素提取物>完整細胞。

圖3 六株紅酵母各分離組分還原力

2.4.2 DPPH· 試驗中分別對6株菌的發(fā)酵上清液、完整細胞和色素提取物進行了DPPH·清除力測定。由圖4可知，6株紅酵母的DPPH·清除能力具有顯著性差異（P<0.05），且趨勢明顯。完整細胞的清除能力最強，清除率均大于89%，其中以 LW3清除率最高，達到97.48%，顯著高于其他菌株；其次為發(fā)酵上清液，其DPPH·清除率在18%-55%之間；色素提取物清除DPPH·的能力最低，均維持在20%-35%。

圖4 六株紅酵母各分離組分DPPH·清除率

2.4.3 ·OH清除能力 試驗中分別對6株紅酵母的3種組分發(fā)酵上清液、完整細胞和色素提取物進行了·OH清除力測定。由圖 5可以看出，完整細胞和色素提取物的·OH清除能力均優(yōu)于發(fā)酵上清液，且6株紅酵母的清除能力存在一定的顯著性差異（P<0.05），可能是由于紅酵母清除·OH的活性物質(zhì)主要存在于細胞內(nèi)，而發(fā)酵上清液中存在較少。

圖5 六株紅酵母各分離組分羥自由基清除率

2.4.4 總抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）能力 根據(jù)DPPH·清除力、·OH清除力及還原力的測定結(jié)果，選取兩株抗氧化能力較好的菌株LW3和LW5，對其發(fā)酵上清液和完整細胞進行T-AOC及SOD活性的測定。表3表明LW3的發(fā)酵上清液和完整細胞的T-AOC和SOD活性均高于LW5。

表3 LW3和LW5的SOD和T-AOC活性

3 討論

紅酵母作為一種重要的真核微生物，在生長過程中可能會面臨各種各樣的脅迫，氧化脅迫是其中之一。H2O2作為強氧化劑，能刺激紅酵母迅速合成具有自我修復(fù)功能的活酵母細胞衍生物（Live yeast cell derivative，LYCD），對細胞起到抗氧化的保護作用［36］。Janda等［37］研究H2O2（0.9-5.3 mmol/L）對黏紅酵母生長狀況的影響，隨著加大H2O2濃度，發(fā)酵液中的菌活數(shù)逐漸降低。Irazusta等［38］發(fā)現(xiàn)暴露于0.5 mmol/L H2O2的膠紅酵母RCL-11生長受到嚴(yán)重抑制，在培養(yǎng)24 h后才開始緩慢生長。倉一華等［39］也曾通過添加H2O2篩選耐受性菌株，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)H2O2濃度達到3 mmol/L時受試紅酵母菌株100%致死。在本研究中發(fā)現(xiàn)6株紅酵母在9 mmol/L H2O2添加量存在下仍具有較高的存活率，均高于上述報道。

有意思的是，在本試驗中H2O2耐受性最高的菌株LW3在總類胡蘿卜素含量上顯著低于菌株LW4，但總類胡蘿卜素含量最高的LW4其H2O2耐受性反而是6株菌中最低的。除此之外，其他4株紅酵母總類胡蘿卜素和H2O2耐受性也不存在線性關(guān)系。有研究表明16 mol/L H2O2處理后降低了R. mucilaginosaC2.5t1的類胡蘿卜素含量和胡蘿卜素生成基因的轉(zhuǎn)錄水平，與膠紅酵母可以調(diào)節(jié)類胡蘿卜素含量來抵消H2O2的促氧化作用的假設(shè)相符［40］。更重要是的，不同種類、含量的類胡蘿卜素對于H2O2的敏感性也存在差異，可能會出現(xiàn)總類胡蘿卜素含量高的菌株其H2O2耐受性不一定最顯著的現(xiàn)象。

有關(guān)紅酵母抗氧化性能方面的研究陸續(xù)已有報道，但到目前為止，對于紅酵母不同組分的抗氧化能力研究甚少。本研究分別對6株紅酵母的發(fā)酵上清液、完整細胞和色素提取物的抗氧化能力進行了比較分析。實驗采用了簡便的化學(xué)方法，應(yīng)用不同自由基系統(tǒng)（還原力、DPPH·自由基和·OH自由基等），以期準(zhǔn)確地反映紅酵母3種組分的抗氧化能力［41］。實驗結(jié)果顯示6株紅酵母的發(fā)酵上清液、完整細胞和色素提取物均具有一定的清除自由基的能力。樣品的還原力與抗氧化能力之間存在著正向關(guān)系，還原力越大，抗氧化能力越強［42］，實驗發(fā)現(xiàn)6株紅酵母3種組分的還原力依次為發(fā)酵上清液>色素提取物>完整細胞，發(fā)酵上清液還原力在0.26-0.39之間，顯著優(yōu)于其他兩個組分。DPPH·作為一種人工合成的具有單電子的有機自由基，可以與抗氧化劑進行單電子配對，溶液的褪色程度與單電子配對數(shù)呈現(xiàn)一定關(guān)系［43］，實驗表明6株紅酵母DPPH·清除能力依次為完整細胞>發(fā)酵上清液>色素提取物?！H是生物分子與過渡金屬離子參與芬頓反應(yīng)造成氧化損傷時所產(chǎn)生的，抗氧化劑能夠螯合過渡金屬離子從而抑制·OH的生成［44］，實驗表明6株紅酵母完整細胞和色素提取物的·OH清除能力顯著優(yōu)于發(fā)酵上清液。對于3種不同自由基的清除，3個組分均展現(xiàn)出不同的能力，這可能是與不同菌株胞內(nèi)胞外的抗氧化活性物質(zhì)的差異和發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的不同有關(guān)。

紅酵母細胞內(nèi)具有多種抗氧化酶以及類胡蘿卜素，不同的類胡蘿卜素保護細胞氧化應(yīng)激和調(diào)控抗氧化的能力各有不同［45-46］。Xu等［47］用5 mg/kg番茄紅素和0.75 mg/kg黃曲霉毒素（Aflatoxin B1，AFB1）給小鼠灌胃給藥30 d后發(fā)現(xiàn)番茄紅素不僅減輕了AFB1誘導(dǎo)的免疫抑制，還增加了總抗氧化能力（T-AOC）和酶活性；裴凌鵬等［48］發(fā)現(xiàn)添加適量的蝦青素可以部分修復(fù)小鼠由于H2O2誘導(dǎo)造成的成骨氧化損傷。另外，研究還發(fā)現(xiàn)耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR）也能夠產(chǎn)生類胡蘿卜素，并且具有很強的抗氧化能力，它所產(chǎn)生的一種特殊類胡蘿卜素deinoxanthin其自由基清除能力遠高于番茄紅素（lycopene）和 β-胡蘿卜素（β-carotene），當(dāng)D. radiodurans的 類 胡蘿卜 素提取物濃度為 0.6 μg/mL時，對DPPH·清除率達到46%［49］，而本實驗中6株紅酵母色素提取物濃度在1.18-1.96 μg/mL，但是DPPH·清除率均低于35%，6株紅酵母的抗氧化能力顯著低于耐輻射奇球菌，這可能與菌株胞內(nèi)的類胡蘿卜素種類及含量有關(guān)。紅酵母胞外發(fā)酵液中還可能存在多糖、抗氧化蛋白等抗氧化物質(zhì)。本試驗中6株紅酵母發(fā)酵上清液還原力明顯高于完整細胞和色素提取物，可能與發(fā)酵液中存在的抗氧化代謝物質(zhì)有關(guān)。馬文錦等［50］研究發(fā)現(xiàn)膠紅酵母胞外多糖具有清除自由基的能力，其多糖組分REPS2-A的還原力為 0.352，DPPH·清除率為49.1%。本實驗中LW1發(fā)酵上清液還原力最大為0.39，DPPH·清除率為55.05%，清除自由基能力優(yōu)于上述結(jié)果。另外，紅酵母細胞壁的組成成分幾丁質(zhì)具有結(jié)合重金屬離子的特性，在重金屬誘導(dǎo)條件下，產(chǎn)生更多的金屬硫蛋白（MT）［51］，體外研究表明MT具有抗氧化活性，能有效清除羥自由基［52］，因此完整細胞表現(xiàn)出較高的·OH清除能力，可能與細胞表面的抗氧化物質(zhì)組成成分有關(guān)。通過分析紅酵母3種組分的抗氧化活性，推測受測菌株的抗氧化能力與胞內(nèi)胞外抗氧化物質(zhì)的差異及發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的不同有關(guān)，其他未知的抗氧化物質(zhì)等相關(guān)研究還有待深入。在未來的研究中我們將進一步分析紅酵母菌株的類胡蘿卜素組分及含量，并動態(tài)跟蹤紅酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)的能力，以期建立全面系統(tǒng)評價紅酵母作為直用液體產(chǎn)品的功效評價方法。

4 結(jié)論

6株紅酵母具有很強的H2O2耐受性（在9 mmol/L H2O2添加量時仍有較高的存活率）；3種組分均具有一定程度的還原力、自由基清除能力、總抗氧化活性及超氧化物歧化酶活性。通過綜合分析研究紅酵母的抗氧化活性，為開發(fā)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的天然抗氧化劑提供菌株資源和理論依據(jù)。