大麗輪枝菌蛋白激發(fā)子PevD1激活本生煙促分裂原活化蛋白激酶MAPK

賈豐蓮 李澤 梁穎博 李廣悅 楊秀芬

（中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室 北京 100081）

促分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是植物細胞內(nèi)重要的信號傳導途徑。在植物與微生物互作過程中，病原物/微生物相關分子模式（Pathogen/microbeassociated molecular patterns，PAMP/MAMP）被植物細胞膜上的識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）識別后能快速激活MAPK級聯(lián)分子，并將底物蛋白上的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化，從而實現(xiàn)信號逐級傳遞。初始的級聯(lián)分子MAPKKK被磷酸化后，通過磷酸化下游的MAPKs分子，形成MAPKKK-MAPKK-MAPK級聯(lián)信號傳導途徑，MAPK進一步磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子靶蛋白，導致大量基因轉(zhuǎn)錄重編程，形成復雜的免疫信號傳遞網(wǎng)絡，最終引起植物抗性基因表達、抗性物質(zhì)積累，使植物產(chǎn)生廣譜抗性。MAPK通路并不是簡單的直線信號傳遞過程，大量與生長發(fā)育和防御相關的分子受到調(diào)控后形成錯綜復雜的植物信號調(diào)控網(wǎng)絡。盡管已明確MAPK參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及逆境響應中的多種信號傳導途徑，是植物免疫的重要防御反應，但是目前僅明確少數(shù)MAPKs級聯(lián)分子的功能［1-2］。已經(jīng)鑒定出完整的MAPK信號通路（MEKK1-MKK4/MKK5-MPK3/MPK6-WRKY22/WRKY29）的上游是鞭毛蛋白flag22激發(fā)子受體FSL2（Flagellin Sensing Locus 2）與BAK1（BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associated receptor kinase 1）復 合 體［3-4］。flg22激活的另一個MAPK級聯(lián)是MAP3K1-MAPKK1/MAPKK2-MAPK4-MKS1，該級聯(lián)介導茉莉酸（Jasmonate，JA）和水楊酸（Salicylate，SA）依賴的防御反應［5］，其中MAPK4 通過其激酶底物MKS1和轉(zhuǎn)錄因子WRKY33 控制植保素camalexin合成酶PAD3的表達。不同植物MAPK通路的級聯(lián)分子功能也不盡相同，擬南芥MAPKs主要有MPK3、MPK4和MPK6，他們均能被非生物脅迫、病原菌侵染和氧脅迫等各種刺激而激活。大豆中MAPKKK（GmMEKK1）通過促進GmMPK6活化和抑制GmMPK3活化來響應flg22的刺激信號，從而不同程度地激活下游MPKs，因此GmMEKK1既能正調(diào)控又能負調(diào)控植物免疫防御反應。大量研究已經(jīng)表明，MAPK級聯(lián)反應在R基因介導的抗病性中發(fā)揮重要作用，通過遺傳學手段已經(jīng)在擬南芥、煙草、番茄和水稻中鑒定出參與R基因介導抗病性的MAPK組分［6-7］。水楊酸誘導的蛋白激酶（alicylic acid-induced protein kinase，SIPK）和傷誘導的蛋白激酶（Wound-induced protein kinase，WIPK）是與煙草防御反應相關的MAPKs。SIPK和WIPK的磷酸化可以激活眾多的轉(zhuǎn)錄因子，特別是WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子，由此調(diào)控與生長發(fā)育和脅迫反應相關基因的表達。ROS能快速而強烈地激活SIPK（AtMPK6），在此過程中需要鈣離子運輸和MAPKK上游的激活。MAPKs在細菌蛋白激發(fā)子Harpin 誘導的細胞壞死中起到核心作用并能調(diào)控煙草細胞壞死反應［8］。

PevD1是本實驗室從大麗輪枝菌培養(yǎng)液中分離的蛋白激發(fā)子，能快速引起煙草葉片組織壞死，激發(fā)植物ROS早期防御反應，引起胼胝質(zhì)，酚類化合物及木質(zhì)素的積累等，提高棉花對大麗輪枝菌、煙草對煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和丁香假單胞菌的抗病性［9-10］。為了研究PevD1誘導抗病性的分子機制，前期利用轉(zhuǎn)錄組測序技術獲得了本生煙響應PevD1誘導的大量差異表達基因，其中有大量基因富集在MAPK信號傳導途徑上，本研究將進一步分析富集在MAPK信號傳導途徑中的差異表達基因的功能，研究MAPK信號途徑中重要基因的表達模式，用特異性SIPK（Salicylic acid-Induced Protein Kinase）和WIPK（Wound-Induced Protein Kinase）磷酸化位點的抗體雜交技術，明確PevD1誘導了本生煙MAPK磷酸化激活，闡述MAPK激活是PevD1誘導植物抗病性的重要機制之一。

1 材料與方法

1.1 蛋白激發(fā)子PevD1表達純化及本生煙培養(yǎng)

構(gòu)建PevD1真核表達載體pPICZαA-PevD1，轉(zhuǎn)化畢赤酵母進行誘導表達，用Ni-NTA純化介質(zhì)（ProteinIso? Ni-NTA Resin，北京全式金）對PevD1-His蛋白進行親和純化，通過SDS-PAGE和Western blot技術驗證了融合蛋白的正確性，具體方法參照文獻［11］；本生煙種子（Nicotiana benthamiana）由本實驗室保存，在25℃下培養(yǎng)21 d的幼苗葉片用于激發(fā)子處理。

1.2 PevD1處理本生煙

將純化的激發(fā)子PevD1蛋白液稀釋成10 μmol/L后，取四周齡的本生煙植株，用無針的注射器在本生煙葉片背部滲透注射，每個葉片注射20 μL，以等量的Tris-HCl（濃度20 mmol/L，pH8.0）為對照。分別在處理后6 h、12 h、24 h葉片取樣，液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 差異表達基因的篩選

根據(jù)華大BGISEQ-500平臺提供的數(shù)據(jù)，使用DEG-seq 進行差異表達基因的篩選。將PevD1處理與Tris-HCl對照之間的基因表達量差異倍數(shù)為兩倍以上（Fold Change >= 2）并且Q-value≤0.001的基因篩選為顯著差異表達基因。在PevD1分別處理6 h、12 h、和24 h的3個時間段中，只要有一個時間點的基因達到篩選標準即視為差異表達基因。

1.4 差異表達基因qRT-PCR檢測

參考茄科數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）的目的基因序列，使用Beacon Designer 8.0軟件設計特異性引物（表1）。以上述樣品提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，以Actin為內(nèi)參基因，采用熒光定量試劑盒（北京全式金）特異性擴增每個目的基因。參照2-ΔΔCt計算方法，分別對mRNA進行相對定量分析。

表1 差異表達基因的引物

1.5 PevD1誘導MAPK級聯(lián)反應的激活檢測

PevD1處理本生煙后，分別在處理后的5 min、15 min、30 min、60 min剪取處理部位的本生煙葉片約200 mg，液氮速凍后，提取總蛋白?？偟鞍自?0%SDS-PAGE電泳后取下凝膠，少量蒸餾水沖洗，凝膠放入1×Transfer buffer中，置搖床輕搖20 min；取兩張轉(zhuǎn)膜專用濾紙和1張PVDF 膜，用100% 的甲醇浸泡PVDF膜，置搖床輕搖 1-2 min；將PVDF膜轉(zhuǎn)入1×Transfer buffer，置搖床輕搖5 min，用1×Tranfer buffer 將濾紙浸透；轉(zhuǎn)膜采用濕轉(zhuǎn)法，按照以下順序組裝：負極-濾紙-膠-膜-濾紙-正極（在緩沖液中組裝，可避免產(chǎn)生氣泡），然后在200 mA，1 h條件下進行電轉(zhuǎn)。取出PVDF膜置于潔凈培養(yǎng)皿中，TBST 洗膜，搖床上輕搖 5 min，重復3次。加入封閉液（5%BSA溶液），搖床上室溫封閉3 h。TBST 洗膜，搖床上輕搖5 min；重復3次。按體積比1∶2 000以封閉液稀釋一抗（Phospho-p44/42 MAPK），加入一抗后，室溫孵育4 h；TBST 洗膜，搖床上輕搖5 min，重復3次；按1∶2 000的比例加入用TBST稀釋的二抗（Anti-rabbit IgG，HRPlinked Antibody），置于搖床上室溫孵育1 h；TBST洗膜，搖床上輕搖5 min，重復3次；將PVDF膜轉(zhuǎn)移到塑料封口膜中，加入1 mL顯色液（EasySee Western Blot，北京全式金），使顯色液與膜充分接觸1min后，用化學發(fā)光儀曝光觀察并保存圖片。進一步對采集的圖片用Image軟件進行灰度分析，定量比較對照與處理間不同時間點磷酸化差異。

2 結(jié)果

2.1 富集在MAPK通路上基因參與植物免疫多種防御反應

分析富集在MAPK通路上的差異表達基因發(fā)現(xiàn)，這些基因參與調(diào)控的功能十分廣泛，除了級聯(lián)分子MAPKKK和MAPKK差異表達外，還有調(diào)控基因表達的轉(zhuǎn)錄因子家族WRKY和ERF，參與識別的蛋白激酶（LRR-RLK），參與抗病的幾丁質(zhì)酶（Chinase）基因。此外，還有大量參與鈣離子信號傳遞的鈣調(diào)蛋白（Calmodulin）、參與活性氧（Reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生和清除的呼吸爆發(fā)氧化酶（Rboh）和過氧化氫酶（Catalase）等（圖1，表2），這些差異表達基因的功能涉及植物免疫過程中識別-信號傳遞-防御物質(zhì)積累-抗病性等各個環(huán)節(jié)。

圖1 蛋白激發(fā)子PevD1誘導的MAPK通路差異表達基因的功能分布

2.1.1 PevD1誘導LRR-RLK基因上調(diào)表達 植物類受體激酶（Receptor-like kinases，RLKs）是植物免疫識別受體的重要成員，其中LRR-RLKs（Leucinerich repeat receptor-like protein kinases）是RLK中研究較多的一類家族，其結(jié)構(gòu)含有識別胞外信號的受體結(jié)構(gòu)域，錨定在細胞膜上的跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)傳遞信號的激酶結(jié)構(gòu)域。目前已經(jīng)鑒定的PAMPs受體均屬于這一類激酶，如細菌flag22受體FLS2［12］，細 菌 延 伸 因 子（EF-Tu）受 體EFR［13］以 及 真菌PAMP幾丁質(zhì)擬南芥受體CERK1和水稻受體CEBiP［14-16］，這些受體與蛋白激酶如BAK1、BIK1、SERK或SOBIR1形成受體復合體共同識別PAMP而激活下游傳導信號，最終使植物產(chǎn)生廣譜抗性［17-18］。擬南芥SIF2屬于LRR-RLK，可以感知病原菌的存在并與BAK1結(jié)合，通過MAPK途徑激活下游防御相關基因的表達，從而調(diào)控植物對病原菌侵染的抗性。幾丁質(zhì)作為真菌PAMP處理水稻后，OsRLCK和PBL27 參與幾丁質(zhì)受體CERK1介導的信號傳導并 控 制MAPK的 激 活［10-20］。總之，LRR-RLKs在啟動植物免疫反應、產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性中具有重要作用，但是目前僅闡述了少數(shù)LRR-RLKs的生物學功能。PevD1誘導后富集在MAPK途徑上的差異表達基因中有62個LRR-RKs顯著上調(diào)表達（圖1），說明PevD1誘導后植物啟動了大量參與識別的類受體激酶，鑒定這些LRR-RLKs將有助于闡述植物識別PAMPs后激活MAPK途徑的信號傳導機制。另外，大量研究表明LRR-RLKs轉(zhuǎn)化植物能提高植物抗病性，如花生AhRLK1轉(zhuǎn)化煙草能顯著提高對病原細菌青枯菌（Ralstonia solanacearum）抗性［21］，進一步研究本實驗鑒定出的LRR-RLKs的功能，有可能為未來分子抗病育種提供有用的基因資源。

2.1.2 PevD1誘導WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，PevD1誘導大量MAPK途徑上的WRKY轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的鋅指型轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族，參與調(diào)控植物各種生理過程，包括對各種生物和非生物脅迫的防御反應。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過與下游靶基因啟動子上的W-box元素結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達［22］，許多WRKY轉(zhuǎn)錄因子的啟動子區(qū)域也有W-box元素，因此它們可以與自身啟動子區(qū)結(jié)合或者與其他WRKY的W-box結(jié)合，實現(xiàn)自我調(diào)控或者交叉調(diào)控［23-24］。WRKY33被MAPK3/6激活后，能結(jié)合在自身啟動子上，通過正向反饋環(huán)實現(xiàn)自動調(diào)控［25］。WRKY18、WRKY40和WRKY60 作為ABA信號的負調(diào)控子能夠直接結(jié)合到其它WRKY基因啟動子區(qū)的W-box上，從而抑制被結(jié)合的WRKY基因的表達［25-27］。WRKYs 位于各種MAPKs 的下游，通過自調(diào)控或者交叉調(diào)控實現(xiàn)細胞中各種WRKY蛋白家族成員間轉(zhuǎn)錄表達的平衡，并通過植物多種信號傳導途徑調(diào)整植物生長和防御之間的平衡，因此同一個WRKY在植物不同發(fā)育階段和不同生長環(huán)境下所發(fā)揮的作用也不盡相同。WIPK和SIPK共享MAPK激酶MEK2的上游［28］，其下游底物是WRKY轉(zhuǎn)錄因子，病原菌侵染誘導的MEK2-SIPK/WIPK-WRKY級聯(lián)反應是植物免疫重要的信號途徑，參與類HR的細胞死亡、呼吸爆發(fā)氧化酶（Rboh）介導的ROS的產(chǎn)生以及對致病疫霉（Phytophthora infestans）的抗病性［29］。煙草WRKY7、WRKY8、WRKY9和WRKY11參與MEK2-SIPK/WIPK級聯(lián)下游的類HR細胞死亡，是細胞死亡依賴和非依賴型植物免疫所必需的［30］。PevD1是誘導HR的蛋白激發(fā)子，通過激發(fā)H2O2的產(chǎn)生和積累，提高氧化酶等防御酶活性，使細胞壁木質(zhì)素含量提高、細胞壁加厚，最終提高棉花對大麗輪枝菌的抗性［10］。PevD1誘導后大量WRKY轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達（圖1），預示著這些WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了PevD1誘導HR和H2O2的調(diào)控過程。

表2 富集在MAPK通路上部分差異表達基因

2.1.3 PevD1誘導ERF轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達 ERF（Ethylene Responsive Factor）是另一個非常重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，其家族成員參與植物生長發(fā)育和各種生物和非生物脅迫反應包括干旱、高鹽、高溫和病害等。ERF一般與靶基因啟動子區(qū)的GCCGCC序列結(jié)合調(diào)控基因的表達。煙草中NtERF3具有誘導煙草葉片細胞死亡的功能，在細胞壞死信號途徑中位于NtSIPK/NtWIPK和NtWRKY1的下游，通過反饋調(diào)節(jié)發(fā)揮其調(diào)控功能［31］。一些ERF基因在植物中表達可誘導PR基因的表達，使植物產(chǎn)生對細菌、真菌或病毒的廣譜抗病性，如在煙草中過表達GbERF2能提高對褐斑病抗性［32］，Tsi1能提高辣椒對病毒、細菌和卵菌的侵染［33］，大豆的GmERF5能提高對大豆疫霉的抗性［34］。在煙草中過表達GmERF3能提高對鹽、干旱和植物病害的抗性［35］。PevD1誘導了大量的ERF轉(zhuǎn)錄因子基因上調(diào)表達，說明這些ERF轉(zhuǎn)錄因子參與了PevD1誘導的細胞壞死和抗病性，深入研究這些轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控功能，不僅對揭示PevD1與植物互作分子機制具有重要意義，而且有望成為植物抗病育種新的基因資源。

2.1.4 PevD1誘導呼吸爆發(fā)氧化酶基因Rboh上調(diào)表達 植物呼吸爆發(fā)氧化酶（Respiratory burst oxidase homologue，Rboh）又稱NADPH氧化酶，在植物生長發(fā)育及脅迫反應中起重要作用，特別是在植物抗脅迫反應中的功能備受關注。在植物識別病原菌或PAMP后產(chǎn)生的各種防御反應中，ROS是最早發(fā)生的防御反應。ROS不僅具有直接抗菌活性，還能作為信號分子進一步激活免疫防御途徑和各種生物過程。植物Rboh氧化酶的主要功能是催化產(chǎn)生ROS，采用病毒誘導基因沉默（VIGS）的方法沉默NbRbohA或NbRbohB基因的植株ROS 生成量降低，同時對致病疫霉菌的抗性降低，且HR受到抑制［36］。Rboh基因目前已在擬南芥、水 稻、煙草和番茄等約10個物種中克隆并進行相關功能研究，其活性主要受Ca2+、蛋白磷酸化、Rac蛋白及ABA所調(diào)控［37］。研究發(fā)現(xiàn)Rboh 蛋白的活性還受Ca2+和磷酸化的協(xié)調(diào)調(diào)控，擬南芥的Ca2+依賴蛋白激酶CPK4、CPK5、CPK6和CPK11是PAMP誘導ROS的正調(diào)控子［38］，CPK5通過磷酸化來調(diào)控RbohD的活性。大量研究已經(jīng)證實，MAPKs（SIPK/ AtMPK6）是被ROS快速而強烈激活并依賴于RbohD［39］。本研究中PevD1誘導大量Rboh基因上調(diào)表達，而且大量編碼鈣調(diào)蛋白（Calmodulin）的基因也大幅度轉(zhuǎn)錄上調(diào)（圖1），預示PevD1誘導產(chǎn)生大量的Ca2+，從而激活RbohD產(chǎn)生ROS。誘導產(chǎn)生的ROS可能通過調(diào)控氣孔關閉、細胞壁加厚、胼胝質(zhì)積累等阻止病原菌的侵入，最終使植物產(chǎn)生抗病性。深入研究調(diào)控Rboh的分子機制，將為進一步闡述激發(fā)子誘導的ROS及其傳遞網(wǎng)絡提供重要理論依據(jù)。

2.2 MAPK通路差異表達基因的表達模式

為了進一步對RNA-Seq的結(jié)果進行驗證，從富集在MAPK通路中的差異基因里選出10個基因進行了qPCR驗證。結(jié)果顯示，大部分基因在誘導后12 h轉(zhuǎn)錄水平達到高峰，隨著時間點推移轉(zhuǎn)錄水平逐漸下降。不同基因表達模式可能與其行使的調(diào)控功能有關，如ACS6是1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸合成酶6，在MAPK途徑中被SIPK/WIPK6磷酸化，參與植物次級代謝產(chǎn)物乙烯的合成，誘導后36 h出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄高峰。ERF1B是響應乙烯的轉(zhuǎn)錄因子也是在MAPK途徑的下游，調(diào)控次級代謝產(chǎn)物的合成，在誘導后24 h出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平高峰。所選擇的10個基因的表達模式在表達趨勢上與RNA-Seq結(jié)果一致（圖2），說明PevD1誘導轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果是準確的。

2.3 PevD1快速激活MAPKs

植物中的MAPK基因在數(shù)目上比較保守，在煙草中已鑒定了17個MAPK基因家族成員，研究較普遍的是SIPK和WIPK。最早發(fā)現(xiàn)SIPK能夠在外源水楊酸存在的煙草懸浮細胞中被誘導表達，WIPK則主要被病原激發(fā)子誘導表達［40］。后來的研究發(fā)現(xiàn)，真菌蛋白激發(fā)子隱地蛋白cryptogein能誘導激活SIPK和WIPK，并伴隨著產(chǎn)生HR和防御基因的表達，說明煙草SIPK和WIPK參與植物免疫信號的傳導。本文用特異性檢測SIPK和WIPK磷酸化位點的抗體來檢測PevD1誘導前后SIPK和WIPK磷酸化反應的差異。從圖3可以看出，PevD1誘導5 min后即觀察到了SIPK和WIPK的磷酸化現(xiàn)象，隨著時間的延長SIPK和WIPK的磷酸化程度逐步增強，并在15 min左右達到最高峰，說明PevD1激活了煙草MAPK，推測可能通過激活MAPK途徑進行免疫信號的傳導，最終使植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。

3 討論

圖2 MAPK通路相關差異表達基因的qPCR驗證

圖3 PevD1處理本生煙后不同時間MAPK激活檢測

PRRs識別外界脅迫信號是植物啟動免疫防御系統(tǒng)的開關，根據(jù)PRRs的細胞定位，植物識別受體包括兩類，一類是位于細胞質(zhì)中的受體，通常是R蛋白，能特異性識別病原微生物產(chǎn)生的效應蛋白（Effectors），由此啟動ETI植物免疫反應，使植物產(chǎn)生較強的抗性；另一類是位于植物細胞表面，能識別胞外的MAMP/DAMP（Damage-associated molecular patterns），從而啟動PTI植物免疫反應［41］，使植物產(chǎn)生較持久的抗性。PTI和ETI有類似的防御反應，如HR、ROS、離子流變化、原生質(zhì)體滲漏、MAPK激活、激素和植保素積累、細胞壁加厚等。盡管已經(jīng)明確了植物PRRs識別PAMP/DAMP是激發(fā)植物免疫防御反應的開關，但是識別后如何進行下游信號傳遞一直沒有詳細闡述，普遍認為，RLK/RLP是連接PRR與MAPK的紐帶［42］。本研究鑒定了眾多的RLK/RLP和各種轉(zhuǎn)錄因子，進一步研究它們的功能將有助于闡述病原菌/激發(fā)子被植物PRR識別后的信號傳遞以及MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡。煙草MAPK途徑中的SIPK和WIPK不僅能被病原菌/激發(fā)子磷酸化激活，還能誘導煙草產(chǎn)生HR，其下游靶標NtWRKY1通過與啟動子區(qū)W-boxes結(jié)合來調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子NsERF3［43］，可見MAPK信號傳導途徑不僅與植物識別產(chǎn)生HR有關，還通過轉(zhuǎn)錄因子以及轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用來調(diào)控多個防御基因的表達，形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡來響應病原菌的侵染或激發(fā)子的刺激。本文證明了PevD1能誘導煙草SIPK和WIPK磷酸化激活，但如何進行下游信號傳遞以及調(diào)控機制尚不清楚，深入研究這些響應PevD1的差異表達基因?qū)﹁b定植物免疫信號傳導網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點具有重要的指導作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，PevD1誘導后使本生煙大量基因轉(zhuǎn)錄重排，通過激活MAPK信號傳導途徑，導致抗性基因上調(diào)表達，最終使植物產(chǎn)生抗病性。