耐熱復(fù)配酶在再造煙葉生產(chǎn)過程中優(yōu)化研究

劉恩芬，彭麗娟，陳正春，趙金濤，陳嶺峰，趙云燕

（1.云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司，云南 昆明 650001；2.云南煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測站，云南 昆明 650001；3.云南中煙新材料有限責(zé)公司，云南 昆明 650001）

煙草物料用熱水浸泡萃取，經(jīng)固液分離將煙草水溶物與煙草纖維等不溶物分離，所得纖維在紙機(jī)上成型成薄片片基，所得水溶物經(jīng)蒸餾濃縮，得到煙草提取液，煙草提取液經(jīng)過基料調(diào)配形成涂布液，然后將涂布液液浸涂到片基上，最后干燥得到再造煙葉產(chǎn)品。目前卷煙原料配方中大部分都添加一定經(jīng)比例的再造煙葉，但再造煙葉存在煙雜氣較重、刺激性大、香氣降低、煙氣柔和度差等缺點(diǎn)。為解決以上問題，從改進(jìn)萃取技術(shù)、優(yōu)化再造煙葉原料結(jié)構(gòu)，達(dá)到提高再造煙葉內(nèi)在品質(zhì)。本文通過系統(tǒng)分析再造煙葉加工工藝各工序中物料的關(guān)鍵組分變化，將適應(yīng)處理工段工藝特性的復(fù)配酶解技術(shù)引入再造煙葉生產(chǎn)工藝中，對原料進(jìn)行處理，提高浸提效率，調(diào)控化學(xué)組分，在提高原料利用率同時提升再造煙葉產(chǎn)品抽吸品質(zhì)。

近年來，國內(nèi)外發(fā)展了一系列針對煙梗的處理技術(shù)，特別是〔1〕基于纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、淀粉酶和蛋白酶的單一性降解作用形成的處理技術(shù)，降低煙梗中纖維素、半纖維素、果膠、淀粉和蛋白質(zhì)等大分子組分物質(zhì)來改善卷煙吸食品質(zhì)。生物技術(shù)已成為發(fā)展最快、應(yīng)用最廣、潛力最大、竟?fàn)幾顬榧ち铱萍碱I(lǐng)域之一，也是最有希望取得關(guān)鍵性突破的學(xué)科之一〔2〕。酶工程是微生物學(xué)和工程學(xué)相互結(jié)合、相互滲透等有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的交叉學(xué)科，酶作為生物催化劑具有催化專一性好、效率高、作用條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、輕工、化工、能源、環(huán)保、檢測等領(lǐng)域，深刻影響著許多重要的科學(xué)和實(shí)踐領(lǐng)域。隨著酶學(xué)研究的進(jìn)一步深入，利用酶技術(shù)改善煙草品質(zhì)已經(jīng)成為煙草行業(yè)的熱點(diǎn)。吳亦集等[3]研究了在煙梗和煙末萃取過程中加入果膠酶、半纖維素酶和蛋白酶，以及酶添加量、酶解溫度和酶解時間對煙末、煙梗中蛋白質(zhì)、全纖維素和果膠含量及其萃取液中還原糖和氨基酸含量的影響。于興偉等[4]以黑曲霉h1為菌株，以煙梗為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。Gravely等[5]提出用E.caratavora培養(yǎng)液降解原料中的果膠和用Asetgillus及Aspergnlusoryzae降解煙梗中的纖維素的微生物酶解方法。Gaisch等[6]在煙草水溶液中加入蛋白酶，利用微生物代謝作用降解煙草水溶液中多肽等，此方法處理過的煙草中蛋白質(zhì)的降解率可達(dá)50%以上。Geisis[7]發(fā)現(xiàn)同時加入E.caratavora（可以產(chǎn)生果酸酶）和T.Longirrachiatum（可以產(chǎn)生纖維素酶）可降解煙梗中果膠和纖維素，提高再造煙葉內(nèi)在品質(zhì)。本項目在不改變現(xiàn)有再造煙葉加工工藝前提下，將適應(yīng)處理工段工藝特性的耐熱復(fù)配酶解技術(shù)引入再造煙葉生產(chǎn)工藝中，對原料進(jìn)行高效處理，提高浸提效率，調(diào)控化學(xué)組分，有效降低再造煙葉加工工藝中的能耗及環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1）原料：梗原料來自云南中煙再造煙葉有限責(zé)任公司。

2）耐熱酶：本實(shí)驗(yàn)所用高溫酶（固體和液體）來自于武漢新華揚(yáng)，詳見表1。

表1 固體單酶技術(shù)要求

3）實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)過程中所用到的溶劑和試劑，無特別說明外，均為分析純，其中用于GC-MS檢測相關(guān)試劑為色譜純，實(shí)驗(yàn)中用到的小型儀器主要包括pH計（FE20，Mettler Toledo），PCR儀（PCT-0220，Biorad），超純水儀（CASCADA LSMK2，Pall），電導(dǎo)率儀（FE30，Mettler Toledo），電子天平（PL3002，Mettler Toledo），超低溫冰箱（DW-86L828，海爾），分光光度計（UV-1800，Shimadzu），微孔讀板機(jī)（Molecular Devices SpectraMaxM2e，美國），HPLC（安捷倫，1260）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐熱多酶復(fù)配體系的開發(fā)、優(yōu)化及應(yīng)用

利用云南中煙提供煙梗原料，用武漢新華揚(yáng)生物股份有限公司銷售的耐熱酶進(jìn)行篩選和復(fù)配研究，形成了五組固體耐熱復(fù)配酶配方和五組液體耐熱復(fù)配酶配方，具體配方組分如表2。

表2 固體復(fù)配酶配方比例

水和生物酶液量（溶劑）添加量煙梗原料量的7倍，生物酶添加量煙梗原料量的10%。五種耐熱復(fù)配酶對煙梗進(jìn)行處理，將二級提取獲得的浸提液利用HPLC進(jìn)行糖分分析，固形物進(jìn)行組分分析，評價耐熱復(fù)配酶的作用效果。

1.2.2 多酶復(fù)合體系酶解工藝實(shí)驗(yàn)操作方法（實(shí)驗(yàn)室）

1）測定煙梗物料含水量：稱取10g煙梗物料置于玻璃平皿中，70℃烘干至恒重（約4h），稱量烘干后物料重量，計算含水量為67.7%。

2）稱取煙梗物料31g（相當(dāng)于10g干物料）置于250mL三角瓶中，三角瓶放在82℃水浴鍋中升溫。

3）計算溶劑（水+復(fù)配酶）量：按照m（溶劑添加量）：m（煙梗） ＝7∶1，計算10g干物料所需溶劑量，稱取復(fù)配酶，并與一定體積水混合。溶劑放于燒杯中，并在82℃水浴中加熱，升溫78℃時加入到盛放煙梗物料的三角瓶中，手動攪拌，時間25min。

4）反應(yīng)結(jié)束后，將三角瓶從水浴鍋中取出，溫度降至室溫后取浸出液，殘留酶活和利用HPLC主要成分變化。

2 耐熱復(fù)配酶作用結(jié)果與討論

2.1 還原糖的增加

利用耐熱復(fù)配酶處理煙梗，煙梗浸提液糖組分結(jié)果如表3所示。與對照（不添加酶）相比，添加耐熱酶處理實(shí)驗(yàn)組浸提液中各種小分子糖含量相對較高，還原糖含量明顯增加，原因是耐熱復(fù)配酶對大分子淀粉和少量纖維素的降解作用。其中TIBLEME6和TIB-LEME9復(fù)配酶降解效果相對較好。

表3 復(fù)配酶處理煙梗浸提液糖組分分析

2.2 大分子物質(zhì)的降低

將二級浸提獲得的固形物進(jìn)行干燥，測定主要大分子物蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素和果膠含量變化，如圖1。與對照實(shí)驗(yàn)相比，五種耐熱復(fù)配酶處理煙梗后，主要大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)、淀粉、纖維素、果膠含量都有所降低。蛋白質(zhì)含量過高，會產(chǎn)生刺激性糊味；淀粉、纖維素含量過高抽吸時一方面會增加焦油含量，產(chǎn)生萘酚等致癌物質(zhì)，另一方面也會產(chǎn)生刺激、嗆咳、燒紙氣味；果膠含量過高，煙草香氣透發(fā)性不良，青雜氣較重，產(chǎn)生甲醇、乙酸等刺激氣味大分子物質(zhì)的含量。通過耐熱復(fù)配酶在加工過中對大分子物質(zhì)部分降解，在改善梗膏的的同時，提高再造煙葉的吸味質(zhì)量，降低刺激性，增強(qiáng)煙氣香味。

圖1 二級浸提圖形物大分子物含量變化

2.3 原料梗處理后產(chǎn)品結(jié)構(gòu)變化

五種耐熱復(fù)配酶處理煙梗后，破壞煙梗結(jié)構(gòu)，使其大分子物質(zhì)發(fā)生變化，測定其纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)、淀粉和果膠含量均有一定變化，說明五種耐熱復(fù)配酶能夠降解煙梗中大分子物質(zhì)，有助于改善再造煙葉品質(zhì)。將經(jīng)過復(fù)配酶高溫浸提的煙梗進(jìn)行電鏡拍照，如圖2所示。經(jīng)過耐熱復(fù)配多酶體系處理后，疏松煙梗結(jié)構(gòu)成多孔纖維，提高煙梗煙葉浸提效率，增加再造煙葉的可填充性和燃燒性，使抽吸過程中燃燒相對更充分，降低有害物質(zhì)的含量。

圖2 煙梗二級浸提固形物的顯微鏡照片

2.4 耐熱復(fù)配酶處理梗原料致香成份的變化

2.4.1 類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的變化

類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物具有明顯的致香作用，有利于醇和煙氣和增加香氣量。由表4看出，在再造煙葉生產(chǎn)過程中，與未經(jīng)過酶處理獲得成品樣品相比，經(jīng)過酶處理獲得的成品其類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增加了22.8%；所選的10種類胡蘿卜素降解產(chǎn)物中，與對照相比，經(jīng)酶處理后β-二氫大馬酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、香葉基丙酮、巨豆三烯酮A、巨豆三烯酮 B、巨豆三烯酮 D、金合歡基丙酮A和金合歡基丙酮B的量都有不同程度地升高，其中β-二氫大馬酮增加量為29%，香葉基丙酮增加量為32%，巨豆三烯酮B增加量為35%，巨豆三烯酮D增加量為30%金合歡基丙酮 A增加量為30%，金合歡基丙酮B的量增加的量最多為53%。

表4 類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的含量變化 μg／g

2.4.2 苯丙氨酸降解產(chǎn)物、西柏烷類降解產(chǎn)物和新植二烯的變化

與未經(jīng)過酶處理獲得成品樣品相比，新植二烯的含量明顯升高，含量增加了38%（表5），新植二烯是一種C20聚類異戊二烯，在煙草中性揮發(fā)物中含量最高，是煙葉中重要的致香物質(zhì)。該成分是煙葉內(nèi)含有的葉綠素在成熟和調(diào)制過程中降解形成葉醇，再由葉醇進(jìn)一步脫水而形成的。新植二烯自身具有清香氣且刺激性較強(qiáng)，而葉綠素和葉綠醇則具有青雜氣。在調(diào)制過程中隨著葉綠素和葉綠醇大量轉(zhuǎn)化成新植二烯，煙葉的青雜氣消除，進(jìn)而產(chǎn)生清香氣。新植二烯在煙草燃燒時可直接進(jìn)入煙氣，具有減少刺激性、醇和煙氣的作用。新植二烯作為捕集煙氣氣溶膠內(nèi)香氣物質(zhì)的載體，具有攜帶煙葉中揮發(fā)性香氣物質(zhì)和致香成分進(jìn)入煙氣的能力，故又為煙葉的重要增香劑。

表5 西柏烷類降解產(chǎn)物中新植二烯的變化 μg／g

3 結(jié)論

1）添加耐熱酶處理實(shí)驗(yàn)組浸提液中各種小分子糖和還原糖含量相對較高，對大分子糖淀粉和纖維素的降解有明顯作用；糖堿比得到了一定的提高，對改善梗絲的香氣品質(zhì)有正面的協(xié)調(diào)作用，可以使再造煙葉產(chǎn)品燃燒更充分，起到降焦減害的作用。

2）經(jīng)過耐熱復(fù)配酶處理過的梗原料，結(jié)構(gòu)更加疏松，產(chǎn)品片基的吸釋性增強(qiáng)，有利用增加片基的涂布率，提高再造煙葉的抽吸品質(zhì)。

3）從香氣成分的含量變化可以看出，在酶的催化作用下，物料的香氣前體物發(fā)生降解、加成和轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，使大分子降解為小分子，復(fù)雜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成簡單結(jié)構(gòu)，獲得較強(qiáng)的致香能力。大部分香氣物質(zhì)的含量增加，各種成分比例更趨協(xié)調(diào)。這種變化類似與在自然醇化時所經(jīng)歷的化學(xué)變化，從而提高了再造煙葉的內(nèi)在品質(zhì)和感官質(zhì)量。