分光光度法測定葡萄糖含量的研究

師改琴，李心怡，孫雅琪，靳文濤，王隨錕，李茹，梁振海

（太原理工大學(xué)現(xiàn)代科技學(xué)院，山西 孝義 032300）

葡萄糖是一種產(chǎn)量大、應(yīng)用廣、價(jià)格便宜易得的醛基糖，也是一種最常見的單糖。由于天然葡萄糖水溶液旋光向右，故屬于 “右旋糖”[1-2]。葡萄糖用途很廣泛，廣泛的應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、食品和工業(yè)制造等行業(yè)中。在醫(yī)學(xué)方面，葡萄糖主要作為營養(yǎng)劑（葡萄糖注射液）運(yùn)用在臨床上。還可以用于葡萄糖鹽水口服液、葡萄糖酸鹽、維生素C等藥品的生產(chǎn)中[3]。在食品工業(yè)方面，葡萄糖是食品中的重要營養(yǎng)成分，廣泛存在于初級食品和加工食品中，可以經(jīng)異構(gòu)酶處理后制造果糖，尤其是含42%果糖的果葡糖漿，已成為當(dāng)前制糖工業(yè)的重要產(chǎn)品[4]。在工業(yè)方面，葡萄糖可以在印染制革工業(yè)中作還原劑，在制鏡工業(yè)和熱水瓶膽鍍銀工藝中常用葡萄糖作還原劑[5]。葡萄糖作為人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)血糖能源的來源，其含量過多或過少均會(huì)引起糖尿病、腎病、視網(wǎng)膜和神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥等病癥[6-9]。因此，建立快速、便捷的葡萄糖測定方法對醫(yī)用化學(xué)和食品分析有著十分重要的意義。

目前對葡萄糖含量的測定方法常用的有滴定分析法[10]、碘量法[11]、高效液相色譜法[12]、酶電極法[13]、旋光法[14]、比色法[15-16]。滴定分析法適用于常量組分的測定，系統(tǒng)誤差較大。高效液相色譜法檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，但對儀器及實(shí)驗(yàn)條件的要求也高。酶電極法成本較高，不適合實(shí)驗(yàn)室用。旋光法操作簡單快捷，但在實(shí)驗(yàn)過程中，存在很多不穩(wěn)定因素影響測量結(jié)果的準(zhǔn)確率。比如在量取、稀釋、熱壓滅菌過程中容易使葡萄糖分解，導(dǎo)致測量的葡萄糖含量的誤差偏大。比色法操作簡單快捷、準(zhǔn)確率高，儀器簡單，僅需要一臺分光光度計(jì)。本文采用DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸試劑）和分光光度計(jì)測量并計(jì)算出未知溶液中葡萄糖的含量，準(zhǔn)確度高。為后續(xù)的葡萄糖轉(zhuǎn)化率的計(jì)算提供了一種方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑與儀器

主要試劑與儀器見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1）配制溶液。顯色劑的配制：稱取3，5-二硝基水楊酸6.5 g，加入少量的水使其溶解，然后定量轉(zhuǎn)移到1000mL的棕色容量瓶中；稱取80 g的氫氧化鈉，溶解后配制成2 mo1／L的氫氧化鈉溶液，量取325 mL轉(zhuǎn)移到裝有3，5-二硝基水楊酸的棕色容量瓶中，再向其中加入稱取好的丙三醇46.24 g，搖勻后放置冷卻，冷卻后用蒸餾水定容到刻度線，搖勻。

系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：

將葡萄糖于烘箱中105℃下2h烘干，然后放在干燥器中保存?zhèn)溆?。稱取上述烘好的葡萄糖10 g，然后加少量的水溶解后轉(zhuǎn)移至1000 mL的容量瓶中，稀釋定容配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7個(gè)干燥的100 mL的容量瓶，分別移入0、10、20、30、40、50、60 mL，稀釋定容，即配得濃度分別為 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mg／mL的系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2）測量波長的選擇。用吸量管吸取0.0、2 mL的上述配好的濃度為3.0 mg／mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入兩個(gè)25 mL的容量瓶中，再分別加入2 mL的3，5-二硝基水楊酸溶液，蒸餾水稀釋至刻度線，搖勻放置。分別取2 mL的上述溶液在中沸水浴加熱2min，自然冷卻。以未加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的試劑為參比溶液，在440～560 nm，每隔20 nm測一次吸光度。圖1為吸光度與波長關(guān)系的吸收曲線。由圖1看出，最大吸收波長為510 nm，但分光光度計(jì)最佳測量值吸收范圍為0.2～0.8 A[16]，所以最終確定相對最大吸收波長540 nm。

圖1 吸收光譜圖

3）DNS顯色試劑用量的確定。比色分析方法中，常常需要加入稍過量的顯色劑。但顯色劑如果加入太多，容易引起副反應(yīng)。取六個(gè)25 mL的容量瓶分別加入1 mL不同濃度的葡萄糖標(biāo)液，分別加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的 DNS試劑，沸水浴反應(yīng)2min，自然冷卻，蒸餾水定容至刻度線，以相同條件下不加葡萄糖的溶液作空白對照，在540 nm下測定吸光度值。圖2為DNS顯色劑用量與吸光度的關(guān)系曲線。由圖2看出，DNS顯色試劑用量在0.5～1.5 mL時(shí)，吸光度值隨DNS試劑的用量增大而增大，DNS試劑用量超過1.5 mL時(shí)，DNS用量繼續(xù)增大，吸光度值處于平緩狀態(tài)。所以，選擇DNS試劑用量為1.5 mL。

圖2 顯色試劑用量對吸光度的影響

4）顯色時(shí)間的確定。取5份3.0 mg／mL的葡萄糖標(biāo)液1 mL，分別加入1.5 mL的DNS試劑。沸水浴中分別加熱1、2、3、4、5、6、7 min，自然冷卻后在540 nm下測定吸光度值。圖3為顯色時(shí)間與吸光度的關(guān)系曲線。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對吸光度的影響

由圖3看出，反應(yīng)時(shí)間在1～2min內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而呈上升趨勢，反應(yīng)時(shí)間超過2min后產(chǎn)物吸光度值不再隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而增大，處于平緩狀態(tài)。所以，反應(yīng)時(shí)間最佳為2min。

5）反應(yīng)溫度的確定。取5份3.0 mg／mL的葡萄糖標(biāo)液1 mL，分別加入1.5 mL的DNS試劑。分別在溫度為70、80、90、100、110℃沸水浴中加熱2 min，自然冷卻后在540 nm下測定吸光度值。圖4為反應(yīng)溫度與吸光度的關(guān)系曲線。由圖4看出，反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值隨著溫度的增加而呈上升的趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度超過100℃后，產(chǎn)物吸光度值不再隨著反應(yīng)溫度的增加而增大，處于平緩狀態(tài)。所以，反應(yīng)溫度最佳為100℃。

圖4 反應(yīng)溫度對吸光度的影響

6）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制。分別移取一定梯度的葡萄糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述最優(yōu)條件下測其吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5為標(biāo)準(zhǔn)曲線。

7）標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的繪制。由圖5看出，葡萄糖質(zhì)量濃度在1～8 mg／mL范圍內(nèi)與DNS試劑反應(yīng)后反應(yīng)液的吸光度值與葡萄糖濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

8）標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液中葡萄糖的含量。未知溶液：前期的葡萄糖雙極電化學(xué)反應(yīng)后陰陽兩極產(chǎn)物。運(yùn)用該方法可以計(jì)算葡萄糖的轉(zhuǎn)化率。將電解液的濃度稀釋到上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中葡萄糖的濃度范圍內(nèi)，在上述測得的最佳條件下測其吸光度，然后在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上找出對應(yīng)的葡萄糖的濃度。再根據(jù)當(dāng)初稀釋的倍數(shù)計(jì)算出電解液中葡萄糖的真實(shí)濃度。

9）重復(fù)性試驗(yàn)。用質(zhì)量濃度為3.0 mg／mL的葡萄糖標(biāo)液與DNS試劑在上述測得的最佳條件下反應(yīng)，在波長540 nm處連續(xù)測定6次吸光度，測定結(jié)果見表2。由表2看出，同一質(zhì)量濃度的葡萄糖溶液與顯色劑DNS的反應(yīng)液在波長540 nm處測定的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)偏差很小，說明該方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高。

圖5 DNS法測定萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)測量結(jié)果

取稀釋后的未知溶液加入DNS顯色劑后在上述條件下連續(xù)6次測其吸光度，結(jié)果看出測得的吸光度值標(biāo)準(zhǔn)偏差很小，說明該方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確率高，可以運(yùn)用在計(jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)化率的應(yīng)用中。

2 結(jié)果與討論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的 DNS法測定葡萄糖含量的最佳波長為540 nm，DNS顯色試劑用量為1.5 mL，顯色時(shí)間最佳為5min。精密度試驗(yàn)表明該方法的準(zhǔn)確率高，運(yùn)用該方法測得未知溶液中葡萄糖的濃度，為葡萄糖電解反應(yīng)提供了計(jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)化率可行的方法。