miR-144-5p對人結(jié)腸癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機制

王鑫鵬 崔現(xiàn) (赤峰市醫(yī)院肛腸外科，內(nèi)蒙古 赤峰 04000；延邊大學附屬醫(yī)院腫瘤科)

結(jié)腸癌也稱為大腸腺癌，是第五大致命癌癥，2018年預計死亡551 000例，占所有癌癥死亡的5.8%〔1〕。在發(fā)展中國家，其發(fā)病率正在穩(wěn)步上升。結(jié)腸癌0～74歲時，死于結(jié)腸癌的累積風險在男性中為0.66%，女性為0.44%〔1〕。盡管有許多治療方法，如外科手術、外科手術結(jié)合化學療法和放射療法，但結(jié)腸癌的中位生存率仍然很差。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性的小RNA分子，長度為18～25 nt。miRNA與靶基因mRNA的3′端非轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合后，可介導其降解或抑制其轉(zhuǎn)錄，因此起到調(diào)控基因功能的作用〔2〕。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與了包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，靶向miRNA可作為治療腫瘤的潛在手段〔3～6〕。本研究檢測一種miRNA分子miR-144-5p在結(jié)腸癌中的表達，并研究其對結(jié)腸癌細胞生長、抗凋亡和轉(zhuǎn)移的影響，旨在為結(jié)腸癌分子靶向治療提供一種新的手段。

1 材料和方法

1.1實驗細胞 人結(jié)腸癌細胞系SW480細胞購自ATCC公司，培養(yǎng)基為10%胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，每3天傳代1次。

1.2主要試劑和儀器 細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自BI公司，噻唑藍(MTT)試劑購自碧云天科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR預混液購自莫納公司。TRIzol購自Invitrogen公司。流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.3MTT分析 將轉(zhuǎn)染了miRNA的SW480細胞接種在96孔板上，然后用15 μlMTT(5 mg/ml)處理4 h。然后除去含有MTT溶液的培養(yǎng)基，再次添加150 μl二甲基亞砜(DMSO)。然后使用550型酶標儀(Bio-Rad，PA，USA)測定490 nm處的分光光度吸光度。每個測定重復3次。

1.4凋亡測定 轉(zhuǎn)染后，通過離心收集細胞并用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。每個樣品都用FITC-Annexin V和碘化丙啶(PI)雙重染色。以1 mg/ml最終濃度添加FITC-Annexin V(Boehringer Mannheim，德國Mannheim)，然后添加10 mg/ml PI。將混合物在黑暗中于室溫下孵育15 min，并使用FACScan流式細胞儀對1×104個細胞的熒光進行定量。每個測定重復3次。

1.5RNA提取和RT-PCR 使用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從細胞中提取總RNA。使用EasyScript第一鏈cDNA合成SuperMix(TransGen Biotech，北京，中國)合成cDNA，并將其用作定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)中的模板。使用TransStartTMSYBR Green qPCR Supermix(TransGen Biotech)在7300 PCR系統(tǒng)(ABI，卡爾斯巴德，美國)上進行PCR反應。 miR-144-5p引物和內(nèi)部參考U6購自廣州日寶生物技術有限公司(中國廣州)。使用2-ΔΔCt方法計算相對RNA水平。

1.6菌落形成試驗 用菌落形成測定法測定細胞的克隆形成性。將細胞接種到3.5 cm板中。處理后，將細胞在細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每3天更換一次新培養(yǎng)基。溫育14 d后，計數(shù)包含直徑大于75 μm的球體孔數(shù)量。實驗進行3次。

1.7細胞刮擦測試 在用miRNA轉(zhuǎn)染后，將SW480細胞處理的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)到6孔板中。當細胞生長至90%匯合時，沿標記線刮擦板表面；將細胞用PBS漂洗2次，并洗去浮細胞。然后將細胞添加到McCoy的5a培養(yǎng)基中，并置于37°C的5%CO2培養(yǎng)箱中，并在飽和濕度環(huán)境下進行培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下分別在0 h和24 h對細胞照相。使用Imagetool軟件計算愈合面積，愈合率=(初始劃痕寬度-已存在的劃痕寬度)/初始劃痕寬度×100%。

1.8統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism7.0軟件進行方差分析及q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-144-5p在結(jié)腸癌組織中的表達 腫瘤組織中miR-144-5p表達水平(0.31±0.17)明顯低于正常組織(1.00±0.22，P<0.01)。 在Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌組織中，miR-144-5p表達(0.22±0.10)明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期(0.54±0.20、0.43±0.14，P<0.01)。

2.2miR-144-5p在體外抑制遷移和侵襲 細胞刮擦試驗結(jié)果表明，與用擾亂的miRNA轉(zhuǎn)染的細胞相比，用miR-144-5p模擬物轉(zhuǎn)染的SW480細胞的刮擦修復率更低，如圖1。

圖1 miR-144-5p抑制體外遷移(×200)

2.3miR-144-5p抑制SW480細胞的增殖并促進其凋亡 用miR-144-5p轉(zhuǎn)染的SW480細胞活力(0.37±0.09)明顯低于Scramble轉(zhuǎn)染的SW480細胞(0.94±0.16，P<0.01)。miR-144-5p轉(zhuǎn)染在體外顯著增強了SW480細胞的自發(fā)凋亡，miR-144-5p組細胞凋亡(17.2%)明顯高于Scramble組(5.8%)及對照組(5.4%，P<0.01)。結(jié)果表明，miR-144-5p可以調(diào)節(jié)SW480細胞的增殖和凋亡。

2.4miR-144-5p抑制SW480細胞中集落形成和腫瘤生長 菌落形成試驗表明，增強的miR-144-5p表達使菌落形成數(shù)目〔(58.4±6.9)個〕明顯少于Scramble組〔(118.2±10.1)個〕和對照組〔(123.4±10.7)個，P<0.01〕。裸鼠成瘤實驗結(jié)果表明，miR-144-5p的給藥極大地抑制了SW480腫瘤異種移植的生長，miR-144-5p組腫瘤體積〔(692.7±96.3)mm3〕明顯低于Scramble組〔(189.6±137.2)mm3〕和對照組〔(1 134.2±148.4)mm3,P<0.01〕。

3 討 論

最近研究表明，miR-144-5p可作為疾病中的有效生物標志物〔3～8〕。Satoh等〔3〕報道，與健康人相比，阿爾茨海默病患者血液樣本中的miR-144-5p和其他26種miRNA的表達失調(diào)，這可能與神經(jīng)元突觸功能有關。與健康對照組相比，抑郁/焦慮癥患者的血漿miR-144-5p水平顯著降低，且與抑郁評分呈負相關〔4〕。在各種類型的腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了異位miR-144-5p表達，包括甲狀腺癌〔5〕、食道癌〔6〕、乳腺癌〔7〕和胃癌〔8〕。但在結(jié)腸癌中的表達仍然未知，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌和結(jié)腸癌細胞系中miR-144-5p表達的水平顯著下調(diào)，與具有較高miR-144-5p表達的患者相比，具有較低miR-144-5p的患者表現(xiàn)出較高的Ki67指數(shù)和較短的PFS，結(jié)果強烈表明miR-144-5p可作為預測結(jié)腸癌預后的有價值的生物標志物〔8〕。

通過Dicer1對pre-miRNA進行加工會生成一個miRNA雙鏈體，該雙鏈體由引導鏈和過客鏈組成。通常，傳代鏈miRNA沒有調(diào)節(jié)活性。但傳代鏈miR-144-3p的抑癌作用已有充分文獻記載〔9～13〕，而對miR-144-5p(來自pre-miR-144的引導鏈)的功能的了解仍然很少。據(jù)報道，miR-144-5p抑制人單核細胞和巨噬細胞中針對結(jié)核分枝桿菌的抗微生物反應。Matsushita等〔14〕報道，miR-144-5p在膀胱癌中被下調(diào)，功能獲得研究表明miR-144-5p抑制癌細胞的增殖。本文結(jié)果表明，miR-144-5p表達的恢復不僅在體內(nèi)外都誘導了結(jié)腸癌細胞的增殖抑制、凋亡和生長停滯，而且還抑制了結(jié)腸癌細胞的遷移和侵襲能力。

綜上，miR-144-5p在體外和體內(nèi)能有效抑制結(jié)腸癌細胞的生長，并在體外促進其自發(fā)凋亡。另外miR-144-5p還可以抑制腫瘤的遷移和侵襲。靶向miR-144-5p可能是預防結(jié)腸癌進展的有效策略。