高危型HPV感染老年宮頸癌患者HPV水平與宮頸局部免疫功能的相關(guān)性

鄭淑敏 章麗 (德州市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 德州 253000)

宮頸部疾病是婦科常見(jiàn)疾病之一，其中宮頸癌位居第二位，且近年來(lái)，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅全球女性的生命安全，現(xiàn)階段已成為公共衛(wèi)生亟待解決的問(wèn)題〔1〕。相關(guān)流行病學(xué)顯示，宮頸癌的發(fā)病主要與人乳頭瘤病毒(HPV)感染、長(zhǎng)期口服避孕藥、性行為等因素有關(guān)〔2〕。HPV屬于DNA病毒，對(duì)皮膚與黏膜上皮均會(huì)造成感染，主要依靠性行為傳播，人類(lèi)是其唯一宿主，高危型HPV感染常導(dǎo)致患者罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加〔3〕。但是僅僅感染HPV，常不足以進(jìn)展為宮頸癌，此外免疫性疾病、機(jī)體微環(huán)境改變等均是致癌因素〔4〕。體液免疫包括CD56+等，細(xì)胞免疫主要是由淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，成熟的T淋巴細(xì)胞只表達(dá)CD4+與CD8+T淋巴細(xì)胞，其中CD4+淋巴細(xì)胞被活化后成為輔助性T細(xì)胞，CD8+淋巴細(xì)被活化后成為具有毒性的T細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞具有特異性殺傷力〔5，6〕。故臨床常用CD4+、CD8+、CD4+/CD8+來(lái)反映組織或協(xié)同局部細(xì)胞免疫情況。目前臨床關(guān)于探究高危型HPV感染的宮頸癌患者體內(nèi)HPV水平與局部免疫功能之間相關(guān)性的研究較少。本研究分析高危型HPV感染的老年宮頸癌患者HPV水平與宮頸局部免疫功能之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1納入對(duì)象 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)制定的相關(guān)審核標(biāo)準(zhǔn)，且均在獲得患者及家屬同意后翻閱患者病歷資料。通過(guò)整群抽樣法，回顧性分析山東省德州市人民醫(yī)院2017年1月至2019年10月明確伴HPV感染的200例宮頸癌患者的臨床資料，并將其納入宮頸癌組，年齡60～78〔平均(69.85±7.23)〕歲；臨床分期：Ⅰ期33例，Ⅱ期78例，Ⅲ期56例，Ⅳ期33例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移122例。將確診為宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)的30例患者臨床資料納入內(nèi)瘤變組，年齡60～76〔平均(68.98±6.99)〕歲；CIN分期：CINⅠ級(jí)7例，CINⅡ級(jí)13例，CIN Ⅲ級(jí)10例。另外納入同時(shí)期內(nèi)健康體檢為慢性宮頸炎的30例志愿者，并將其納入慢性宮頸炎組，年齡60～80〔平均(69.23±7.11)〕歲。上述3組受試者一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究具有可比性。

1.2入選及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①除了慢性宮頸炎之外，其余患者經(jīng)病理組織確診，且已明確組織性質(zhì)及臨床分期與分級(jí)；②經(jīng)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)明確伴HPV感染；③受試者均有性生活史；④受試者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組半年內(nèi)伴局部或全身免疫增強(qiáng)劑治療；②重要臟器功能受損嚴(yán)重者；③伴其他部位惡病質(zhì)者；④兩組或多重HPV感染；⑤采樣前3 d內(nèi)陰道未用藥。

1.3采集樣本 采用一次性無(wú)菌擴(kuò)陰器撐開(kāi)受試者陰道，使宮頸充分暴露，用棉簽輕輕拭去宮頸處的分泌物。采用潮州凱普生物有限公司生產(chǎn)的HPV錐形宮頸刷，在宮頸口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5圈以上后取出，放置在專(zhuān)用細(xì)胞保存液的取樣管中，折斷刷柄，蓋好管蓋，并標(biāo)記好受試者姓名、年齡等一般信息，避免混淆，在取樣過(guò)程中注意保護(hù)受試者隱私，防止交叉感染，且所有受試者的樣本取樣由同一組婦產(chǎn)科醫(yī)師完成。

1.4HPV-DNA檢測(cè)方法 采用mRNA抽提與反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，利用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)步驟與方法嚴(yán)格遵循試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.5宮頸局部免疫指標(biāo)水平檢測(cè) 所有入組受試者于入院次日清晨，空腹?fàn)顟B(tài)下抽取3 ml肘靜脈血，選用由美國(guó)BD Biosciences Accuri C6流式細(xì)胞檢測(cè)儀，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)局部免疫指標(biāo)水平。具體檢測(cè)方法：將血標(biāo)本置于4℃保存，并在1 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，將淋巴細(xì)胞濃度調(diào)整至5×106/L利用臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色，明確活細(xì)胞率>85%，取100 μl全血加入測(cè)定管中，并加入磷酸鹽緩沖液稀釋至200 μl，再加入流式細(xì)胞術(shù)專(zhuān)用抗體20 μl搖勻，避光保存在4℃冰箱內(nèi)30 min，加入紅細(xì)胞裂解液裂解。直至出現(xiàn)澄清液體，利用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，再次加入0.1%的甲醛溶液固定細(xì)胞，2 h后上機(jī)檢測(cè)。

1.6評(píng)價(jià)指標(biāo) 比較3組受試者HPV及宮頸局部免疫功能各指標(biāo)〔CD8+、調(diào)節(jié)性細(xì)胞(Treg)、CD4+、CD4+/CD8+、CD56+〕水平，并分析HPV水平與宮頸局部免疫功能各指標(biāo)的相關(guān)性。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)、雙變量Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HPV陽(yáng)性者宮頸局部組織免疫組化染色 見(jiàn)圖1。

2.2各宮頸疾病患者HPV水平及免疫指標(biāo)水平 HPV、CD8+、Treg水平宮頸癌組>CIN組>慢性宮頸炎組，CD4+、CD4+/CD8+、CD56+水平宮頸癌組

圖1 HPV陽(yáng)性宮頸局部組織免疫組化染色(DAB，×200)

表1 各組HPV水平及免疫指標(biāo)水平比較

2.3HPV與各免疫指標(biāo)之間的相關(guān)性 CD4+、CD4+/CD8+、CD56+與HPV之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.468，-0.252，-0.078，均P<0.001)；CD8+、Treg與HPV之間呈正相關(guān)(r=0.221，r=0.180，均P<0.001)。

3 討 論

宮頸癌是婦科常見(jiàn)惡性腫瘤之一，2016年全國(guó)腫瘤登記中心發(fā)表的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)宮頸癌占女性特有惡性腫瘤第二位，且近年來(lái)，我國(guó)宮頸癌的患病率與死亡率呈逐年上升趨勢(shì)〔7〕。目前諸多國(guó)家已將對(duì)適齡女性的宮頸癌篩查納入國(guó)家醫(yī)療保障體系，但諸多發(fā)展中國(guó)家女性的宮頸癌癌前病變篩查并未能有效實(shí)施，導(dǎo)致罹患宮頸癌的女性患者仍較多，特別是老年人群，其機(jī)體各系統(tǒng)功能低下，機(jī)體防御能力較低，罹患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)較其他人群高，故早發(fā)現(xiàn)、早治療對(duì)宮頸癌的防治具有重要意義〔8，9〕。

本研究結(jié)果表明高危型HPV感染宮頸癌患者HPV水平呈高表達(dá)，且HPV水平與宮頸局部免疫功能指標(biāo)之間關(guān)系密切。HPV是一種微小的DNA雙鏈病毒，長(zhǎng)約55 nm，含有8 000個(gè)堿基對(duì)，對(duì)皮膚及黏膜上皮均會(huì)造成嚴(yán)重感染，人類(lèi)是HPV易感染宿主。HPV的致病機(jī)制主要表現(xiàn)在：①HPV-DNA整合、整合位點(diǎn)與宮頸癌之間的關(guān)系：宮頸腫瘤早期，HPV16、HPV18 DNA均整合到宿主細(xì)胞基因組中，伴隨宮頸局部組織的不斷進(jìn)展，HPV-DNA整合入宿主的基因不斷增多，而HPV-DNA的高度整合又負(fù)性促進(jìn)宮頸病變的惡性程度，如此形成惡性循環(huán)，誘發(fā)病情不斷加重〔10，11〕。②HPV E2破壞與宮頸癌之間的關(guān)系：E2蛋白是HPV基因組編碼中具有特異性的DNA束縛蛋白，對(duì)病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄及DNA賦值具有調(diào)控作用，對(duì)E6、E7的表達(dá)具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用；此外，其還能夠通過(guò)病毒啟動(dòng)周?chē)幕蛐蛄校M(jìn)而對(duì)轉(zhuǎn)錄過(guò)程進(jìn)行抑制，當(dāng)E2遭到破壞時(shí)，其負(fù)反饋調(diào)節(jié)功能也隨之消失，導(dǎo)致致癌基因E6、E7的高表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體組織發(fā)生癌變〔12，13〕。人群在感染HPV之后，通過(guò)啟動(dòng)免疫系統(tǒng)來(lái)對(duì)HPV感染進(jìn)行有效清除，機(jī)體免疫系統(tǒng)主要包括固有免疫與適應(yīng)性免疫，其中適應(yīng)性免疫包括T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫與漿細(xì)胞抗體介導(dǎo)的體液免疫，其中細(xì)胞免疫在HPV拮抗方面具有重要意義〔14〕。由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫細(xì)胞成熟狀態(tài)下主要表現(xiàn)為CD8+與CD4+，其中CD4+負(fù)責(zé)啟動(dòng)免疫，CD8+執(zhí)行免疫，被病毒感染的細(xì)胞能夠被CD8+直接殺死；CD4+主要分為T(mén)h0、Th1、Th2亞型，Th0在抗原刺激下發(fā)育為T(mén)h1、Th2亞型，并分泌腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-6等細(xì)胞因子，上述細(xì)胞因子均能夠介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體，參與免疫反應(yīng)；CD8+細(xì)胞在各細(xì)胞因子的作用下，釋放穿孔素、顆粒酶等，對(duì)靶細(xì)胞起到殺傷作用〔15，16〕。CD56+主要存在脾臟、血液等部位，屬于自然殺傷細(xì)胞的標(biāo)志物，在沒(méi)有致敏淋巴細(xì)胞與抗體作用下，CD56+即可對(duì)腫瘤靶細(xì)胞進(jìn)行抑制、殺傷〔17〕。Treg在宮頸癌變過(guò)程中對(duì)免疫系統(tǒng)具有顯著抑制作用，可幫助腫瘤靶細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視而繼續(xù)存活，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)腫瘤細(xì)胞積聚，最終致病〔18〕。

綜上所述，高危型HPV感染的老年宮頸癌患者HPV水平呈高表達(dá)，且HPV水平與宮頸局部免疫功能指標(biāo)之間關(guān)系密切，臨床可通過(guò)檢測(cè)宮頸局部組織免疫指標(biāo)水平情況，為高危型老年宮頸癌患者的早期診斷與預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。