海藻酸鈉復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞對(duì)兔佐劑性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA、 Foxp3 mRNA表達(dá)的影響

易偉 張旭東，2 蔣雯雯 韋登明

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，浙江 寧波 315211;2湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見病和多發(fā)病，但其發(fā)病機(jī)制仍然不是十分清楚。近年來研究表明RA的發(fā)生與輔助性T細(xì)胞17型/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Th17/Treg)的失衡有關(guān)〔1，2〕。維甲酸相關(guān)核孤受體(ROR)γt mRNA通過調(diào)控Th17細(xì)胞，增加其分泌白細(xì)胞介素(IL)-17、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等多種細(xì)胞因子的水平而加重炎癥反應(yīng)。Treg細(xì)胞是一類CD4+T細(xì)胞亞群，受轉(zhuǎn)錄因子叉頭蛋白(Fox)p3 mRNA調(diào)控，Treg可通過分泌抑炎因子(IL-10、TGF-β、IL-35等)來抑制免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)〔3〕。前期研究表明海藻酸鈉復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞可修復(fù)兔佐劑性關(guān)節(jié)炎軟骨缺損，并且有明顯的抗炎作用，但其抗炎作用不是十分清楚〔4〕。而海藻酸鈉復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞對(duì)于RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的影響未見報(bào)道。本文旨在探討海藻酸鈉復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)RORγt mRNA、Foxp3 mRNA水平抗兔佐劑性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 從浙江省余姚泗門鎮(zhèn)建飛實(shí)驗(yàn)兔養(yǎng)殖場〔許可格證號(hào)：SCXK(浙)2012-0050〕購入40只新西蘭兔(清潔級(jí)，二月齡，體重2～3 kg，雄性)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機(jī)分為對(duì)照組(A組)，模型組(B組)，細(xì)胞治療組(C組)，支架治療組(D組)，支架復(fù)合細(xì)胞組(E組)各8只。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海橋杜生物科技有限公司)；兔抗TGF-β1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；TGF-β1、胰島素樣生長因子(IGF)-1(美國peprotech公司)；阿利新藍(lán)(上海生工生物工程有限公司)；EasyPure?RNA Kit、2×TransTaq?High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix、EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；完全弗佐劑(FCA)、海藻酸鈉粉劑(美國sigma公司)；UltraPower?DNA染料、6×上樣緩沖液(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 臺(tái)式超高速低溫離心機(jī)(Centrifuge 5810R，德國Eppendorf 公司)、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國ThermoFisher Scientific公司)、包埋機(jī)(BM-Ⅶ，宏業(yè)醫(yī)用儀器公司)、石蠟切片機(jī)(HM-325，德國LEICA公司)、PCR儀(3522，購于德國Eppendorf 公司)、全波長酶標(biāo)儀(美國ThermoFisher Scientific公司)、電泳儀(DYY-11B，北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(Molecular Image Gel Doc，購于美國Bio-Rad公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1兔佐劑性關(guān)節(jié)炎(AA)模型制備 20%烏拉坦靜脈按5 mg/kg的劑量注入麻醉動(dòng)物，麻醉起效后，將0.5 ml FCA注入動(dòng)物膝關(guān)節(jié)，14 d后再次注入FCA。3 w后察看兔子膝關(guān)節(jié)，若紅腫增粗則造模成功。

1.4.2種子細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 從兔骨髓中穿刺抽取間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞，其過程包含分離純化、培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化、鑒定等操作〔4〕，其主要步驟：兔骨髓液抽?。河?0%烏拉坦麻醉動(dòng)物后，抽取膝關(guān)節(jié)骨髓液5 ml左右。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：用等量percoll淋巴細(xì)胞分離液與抽取的骨髓液混合，以2 000 r/min離心15 min，吸取8 ml培養(yǎng)液加入并充分混勻，1 200 r/min，離心5 min，棄上清液，重復(fù)一次，將percoll分離液洗去，移入培養(yǎng)瓶置于二氧化碳培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)。軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)：培養(yǎng)48 h后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞呈梭形渦旋狀分布，細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)，胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。至P3代自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)，在常規(guī)培養(yǎng)液中加入約10%的誘導(dǎo)劑換液培養(yǎng)細(xì)胞，約2 w后自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞絕大部分可誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞的鑒定：軟骨細(xì)胞多呈現(xiàn)星形、多角形。阿利新藍(lán)染色時(shí)細(xì)胞呈藍(lán)色即陽性。

1.4.3種子細(xì)胞與支架的混合 于24孔培養(yǎng)板中每孔加入400 μl的6%的海藻酸鈉凝膠與培養(yǎng)基的混合物，再加入1%CaCl2溶液20 μl，于15 min后吸取全部的CaCl2后加入細(xì)胞培養(yǎng)液。將支架與種子細(xì)胞懸液放入20 ml注射器內(nèi)，抽注射器讓細(xì)胞懸液與支架材料混勻后培養(yǎng)。

1.4.4支架復(fù)合物的治療 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物耳緣靜脈麻醉后，A組、B組于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.5 ml生理鹽水；C組注入等量海藻酸鈉支架；D組注入等量軟骨細(xì)胞；E組注入等量支架復(fù)合軟骨細(xì)胞。

1.4.5兔膝關(guān)節(jié)滑膜蘇木素-伊紅(HE)染色 治療30 d后處死動(dòng)物，取兔子膝關(guān)節(jié)，甲醛溶液固定后脫鈣，取材，經(jīng)過水洗、脫水透明、切片脫蠟、HE染色等操作，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.6ELISA檢測(cè)外周血細(xì)胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表達(dá) 用兔外周血3 ml離心后取上層液，按照試劑盒說明書用ELISA檢測(cè)外周血細(xì)胞因子TGF-β1、IL-10、IL-22表達(dá)。

1.5RT-PCR檢測(cè)Foxp3 mRNA和RORγt mRNA 的表達(dá) 使用Trizol法提取總RNA。用2 μl ddH2O調(diào)零，吸取2 μl RNA，測(cè)定RNA溶液260/280的比值和濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按說明書操作。RT-PCR使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)，合成，純化。RORγt mRNA引物：上游：5′-TCTGGAAGCTGTGGGATAGA-3′；下游：5′-GAGGAGCCTGTGGAGAAATAC-3′。Foxp3 mRNA引物：上游：5′-GGCCCTTCTCCAGGACAGA-3′；下游：5′-GCTGATCATGGCTGGGTTGT-3′。GAPDH：上游：5′-CCTCATGCCATCCTGCGTCT-3′；下游：5′-GCCACAAGGATTCCATACCCA-3′。PCR體系如下：cDNA 5 μl；上游引物(10 μmol/L)1 μl；下游引物(10 μmol/L)1 μl；2×TransTaq?HiFi PCR SuperMix25 μl；ddH2O 18 μl；總計(jì)50 μl。PCR條件：94℃ 30 s預(yù)變性；94℃ 5 s，60℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行方差分析，Dunnett-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1AA模型制備結(jié)果 B組關(guān)節(jié)外觀紅腫，其內(nèi)可見增生現(xiàn)象和積液，并見乳白色軟骨。A組關(guān)節(jié)無紅腫，可見透明軟骨，未見增生現(xiàn)象。

2.2細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)P3代成功后，加入誘導(dǎo)液使其分化成軟骨細(xì)胞，用阿利新藍(lán)染色，藍(lán)色顯示誘導(dǎo)成功。

2.3關(guān)節(jié)滑膜的HE染色結(jié)果 A組關(guān)節(jié)滑膜無異常，無炎細(xì)胞，B組炎細(xì)胞較多，C組、D組、E組較B組炎癥情況均有所改善。

2.4各組兔外周血中TGF-β1、IL-10、IL-22的ELISA檢測(cè)結(jié)果 與B組相比，A、E組兔外周血TGF-β1水平明顯多(P=0.002，P<0.007)，C組及D組TGF-β1差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組外周血IL-10、IL-22水平與B組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.5RT-PCR檢測(cè)各組兔滑膜中Foxp3 mRNA與RORγt mRNA的表達(dá)量水平比較 與B組相比，A組兔關(guān)節(jié)滑膜中Foxp3 mRNA的表達(dá)水平高(P<0.05)，RORγt mRNA表達(dá)水平明顯低(P<0.01)，C組和D組Foxp3 mRNA表達(dá)水平無差異(P>0.05)，E組Foxp3 mRNA表達(dá)水平高于B組(P<0.05)，C、D、E組RORγt mRNA表達(dá)水平明顯低于B組(P<0.05，P<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組免滑膜中Foxp3、RORγt mRNA表達(dá)比較

圖1 兔關(guān)節(jié)滑膜中Foxp3、RORγt mRNA電泳條帶

3 討 論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過改變生長環(huán)境誘導(dǎo)形成軟骨細(xì)胞，再與海藻酸鈉支架復(fù)合成組織工程化細(xì)胞，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎有明顯的抗炎療效〔4，5〕。海藻酸鈉支架不僅可以給軟骨細(xì)胞的增殖分化提供適宜的場所，而且與滑膜有較好的生物相容性，其降解產(chǎn)物無毒，是目前作為支架材料的完美選擇〔5～7〕。

目前一致認(rèn)為RA和病人關(guān)節(jié)中的淋巴細(xì)胞及其分泌的多種炎癥因子聯(lián)系密切〔8〕。最近研究表明Th17/Treg和RA的發(fā)生密切相關(guān)，上述2種細(xì)胞對(duì)RA患者關(guān)節(jié)軟骨的破壞產(chǎn)生重大影響，已有研究表明〔9，10〕，Th17/Treg介導(dǎo)RA的免疫反應(yīng)。初始T細(xì)胞可分化為Th17或Treg，Th17受RORγt mRNA調(diào)控，而低濃度的 TGF-β1和 IL-6 可共同誘導(dǎo) RORγt 的表達(dá)。Th17可產(chǎn)生IL-17、IL-6、IL-22等，其中IL-17是主要的促炎效應(yīng)因子，關(guān)節(jié)破壞與IL-17有關(guān)，并且IL-17還可通過活化滑膜細(xì)胞及上調(diào)造血因子的表達(dá)致使滑膜增生，加重RA的發(fā)生發(fā)展〔11，12〕。Treg可增加機(jī)體的自身耐受且保持對(duì)炎癥因子的免疫無反應(yīng)性〔13〕。本研究結(jié)果提示海藻酸鈉支架或工程化軟骨細(xì)胞均有一定的抗炎作用。支架復(fù)合軟骨細(xì)胞可提高關(guān)節(jié)滑膜Foxp3 mRNA表達(dá)水平降低RORγt mRNA表達(dá)水平從而起到抗炎作用。

TGF-β1是影響初始T細(xì)胞向Th17/Treg的分化的主要因素。TGF-β1低表達(dá)可與IL-6共表達(dá)增加Th17的分化，TGF-β1高濃度增加Treg的分化〔14〕。本研究結(jié)果提示TGF-β1可能通過影響RORγt mRNA、Foxp3 mRNA進(jìn)而影響初始T細(xì)胞的分化方向來影響各組RA的發(fā)生發(fā)展。

IL-10是T細(xì)胞和APC的抑制因子，能夠改善RA滑膜炎癥情況，下調(diào)破骨細(xì)胞的激活，也可減輕關(guān)節(jié)腫脹程度，改善軟骨損壞情況。但也有研究表明IL-10可增加成熟B細(xì)胞數(shù)量并阻止B細(xì)胞凋亡從而達(dá)到致炎作用。目前有研究表明〔15～17〕關(guān)于RA患者血清中IL-10的檢測(cè)結(jié)果不一致，表達(dá)量有升高也有降低的。本研究結(jié)果顯示，與B組相比，各組血清中IL-10的表達(dá)量無變化。造成此現(xiàn)象的原因可能有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是兔，與RA患者存在表達(dá)上的區(qū)別，其次IL-10主要表面在滑膜細(xì)胞膜上或存在于滑液中，而關(guān)節(jié)的營養(yǎng)供應(yīng)不足，較小范圍的炎癥反應(yīng)未能觸發(fā)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)功能，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的是血清中的IL-10。關(guān)于RA患者中外周血IL-10與RA的關(guān)系需要更多實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證研究。

IL-22由Th1、Th17、Th22等細(xì)胞產(chǎn)生，在RA進(jìn)程中起重要作用。IL-22與骨破壞X線分期呈正向關(guān)聯(lián)(P<0.05)，是骨破壞的危險(xiǎn)因素，可用于評(píng)價(jià)RA的病情〔18〕。對(duì)RA患者外周血IL-22檢測(cè)結(jié)果顯示，RA組IL-22濃度高于對(duì)照組(P<0.05)〔19〕；RA患者滑膜組織檢測(cè)結(jié)果顯示，與健康人相比，IL-22 mRNA的表達(dá)水平增加，IL-22受體的轉(zhuǎn)錄水平也隨之增加〔20〕。本研究結(jié)果與以往研究不同的原因可能是機(jī)體是一個(gè)協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體，一個(gè)免疫反應(yīng)發(fā)生，其對(duì)應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)也應(yīng)激產(chǎn)生，使機(jī)體維持在一定的平衡之中。滑膜炎癥的產(chǎn)生使機(jī)體中抑炎因子也會(huì)相應(yīng)分泌，而局部炎癥未能引發(fā)全身免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，因此血清中IL-22可能無明顯變化。