降糖藥物相關(guān)基因芯片檢測(cè)技術(shù)的建立和應(yīng)用

盧雪玲 再努爾·買(mǎi)合木提 王寧

(新疆醫(yī)科大學(xué) 1第二附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000；2第一附屬醫(yī)院)

糖尿病(DM)是一種以高血糖為特征的內(nèi)分泌代謝紊亂綜合征〔1〕，肥胖、家族遺傳、運(yùn)動(dòng)缺乏等是引起DM的主要危險(xiǎn)因素〔2〕。DM主要分為4種類型，其中90%以上為2型糖尿病(T2DM)〔3〕。雖然普遍認(rèn)為T(mén)2DM基本致病機(jī)制是胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷，但其發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚，但研究表明是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果〔4，5〕。目前T2DM的治療包括飲食、運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)和口服降血糖藥物。但口服降血糖藥由于遺傳因素在個(gè)體間藥效動(dòng)力學(xué)和不良反應(yīng)等存在差異〔6〕。故從基因水平上研究降糖藥物相關(guān)基因多態(tài)性，對(duì)指導(dǎo)個(gè)體差異化治療、避免不良反應(yīng)和提高藥物安全性有重要作用〔7〕。從化學(xué)結(jié)構(gòu)分類看降糖藥物分為5類〔8〕。磺脲類口服降血糖藥物通過(guò)與受體結(jié)合，引起K+-ATP通道關(guān)閉，β細(xì)胞膜去極化，鈣離子濃度升高，進(jìn)而使胰島素分泌增加，相關(guān)的基因有 CYP2C19、KCNJ11、ABCC8、TCF7L2 和 IRS(胰島素受體底物)1等〔9～11〕。雙胍類(二甲雙胍、苯乙雙胍)口服降血糖藥物能促進(jìn)脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取，拮抗抗胰島素因子，相關(guān)基因有有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體基因(OCT)1和OCT2，二者分別在肝臟和腎臟中表達(dá)〔12〕。胰島素增敏劑(噻唑烷二酮類)可促進(jìn)脂肪酸氧化和糖的吸收，增加骨骼肌、肝臟、脂肪組織對(duì)胰島素的敏感性，相關(guān)基因有PPARγ和脂連素基因(APM)1〔13〕。促胰島素分泌藥(非磺脲類)降糖藥物包括瑞格列奈(諾和龍)和那格列奈，作用機(jī)制為通過(guò)刺激胰腺釋放胰島素而使血糖水平快速降低，但增加了低血糖的風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)基因有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(OATP1)〔14〕?；蛐酒腔诜肿由飳W(xué)中核酸互補(bǔ)雜交原理的一門(mén)新技術(shù)，具有高通量、大規(guī)模、平行性等特點(diǎn)，對(duì)于不同個(gè)體藥物篩選有非常重要作用〔15〕?；谔悄虿』颊邆€(gè)體間遺傳突變位點(diǎn)多，異質(zhì)性強(qiáng)及人群患病率及攜帶致病基因的比例高等特點(diǎn)，建立快捷、高通量的基因診斷方法對(duì)差異化治療和安全用藥有重要意義。本研究以P450酶基因和OCTs相關(guān)基因?yàn)楹蜻x基因，通過(guò)Fluidigm公司生產(chǎn)的帶有12個(gè)SNP位點(diǎn)的芯片檢測(cè)門(mén)診收集的34例糖尿病患者。

1 材料和方法

1.1一般資料 34例患者均來(lái)自新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科門(mén)診，均為維吾爾族，男13例，女21例，于2016年1～12月收集，年齡為26～80〔平均(52.7±6.72)〕歲，病程(6.24±3.31)年。在進(jìn)行體重指數(shù)(BMI)、血糖、總膽固醇(TC)和三酰甘油(TG)、血漿胰島素和C肽等生理指標(biāo)測(cè)定確診為DM后。經(jīng)知情同意，對(duì)所有患者進(jìn)行病史調(diào)查(包括家族史、DM史及降糖藥物使用情況等)，同時(shí)進(jìn)一步明確DM類型。

1.2基因芯片技術(shù)建立相關(guān)材料 稀釋液、晶芯BioMark HD微陣列芯片掃描儀、Juno分析系統(tǒng)、質(zhì)控探針和 DNA 芯片、雜交盒(SNPtypeTMGenotyping Kit)及雜交試劑均由Fluidigm公司提供。PCR熒光染料和質(zhì)控探針?lè)謩e購(gòu)自QIAGEN和Life Technologies。

1.3樣本采集和處理 在征得研究對(duì)象知情同意后，用EDTA抗凝采血管抽取外周靜脈血5 ml。所有血樣用小量基因組DNA抽提試劑盒(英捷領(lǐng)先生物)提取DNA，利用核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA的純度和濃度，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物及探針設(shè)計(jì) 探針和引物采用Fluidigm SNP Type Assay Design網(wǎng)站設(shè)計(jì)合成，每個(gè)位點(diǎn)都有3個(gè)對(duì)應(yīng)的引物：STA、LSP和ASP1/ASP2，見(jiàn)表1。

1.5基因芯片構(gòu)建及檢測(cè) 通過(guò)文獻(xiàn)篩查，我們發(fā)現(xiàn)12個(gè)位于P450酶基因和OCTs相關(guān)基因上的SNP位點(diǎn)，這些位點(diǎn)均已證明與遺傳性糖尿病有相關(guān)性。以提取的DNA為模板，采用多重等位基因特異性PCR (ARMS-PCR)同時(shí)結(jié)合芯片技術(shù)。選取帶有Tag標(biāo)簽序列的基因位點(diǎn)特異性引物擴(kuò)增SNP位點(diǎn)所在的片段并進(jìn)行熒光標(biāo)記。

1.5.1PCR 多重PCR體系：將2組引物分成A和B兩個(gè)反應(yīng)體系，各加入DNA 0.5 μg，等位基因特異性引物(ASP1和ASP2)各100 μmol/L，位點(diǎn)特異性引物(LSP)100 μmol/L，補(bǔ)充DNA擴(kuò)增混合液至終體積為40 μl。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性，96℃ 1 min；擴(kuò)增，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)；延伸：70℃ 45 s，60℃ 10 min。該過(guò)程終降溫速率為0.4℃/s，升溫速率為0.2℃/s。

1.5.2雜交與清洗 將標(biāo)記的DNA加熱至95℃變性5 min后，立即冰浴3 min。從不同擴(kuò)增體系中(同一模板)各取2.5 μl PCR產(chǎn)物加到10 μl雜交緩沖液，將混合液加到芯片的微陣列區(qū)域，50℃預(yù)熱水浴中雜交1 h。雜交結(jié)束后，在42℃洗滌液中洗滌2 min，之后在0.2×SSC溶液中室溫洗5 min，甩干后掃描。

表1 12個(gè)SNP位點(diǎn)的引物和探針

1.5.3結(jié)果判定 利用Fluidigm SNP Genotyping Analysis軟件(Fluidigm公司，美國(guó))，針對(duì)降糖藥物相關(guān)基因常見(jiàn)的12個(gè)突變位點(diǎn)(表2)進(jìn)行基因分型分析。

表2 12個(gè)降糖藥物相關(guān)基因位點(diǎn)信息

2 結(jié) 果

2.1降糖藥物相關(guān)基因芯片檢測(cè)結(jié)果 基因芯片檢測(cè)34例糖尿病患者，1例發(fā)生rs10509681，rs11572080和rs662301突變，3例發(fā)生rs12208357突變，4例發(fā)生rs1057910突變，5例發(fā)生rs4149056突變，6例發(fā)生rs11920090突變，8例發(fā)生rs72552763堿基缺失，12例發(fā)生rs316019和rs683369突變，發(fā)生rs2016520突變的患者最多，達(dá)15例。

2.2突變位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)分析 12個(gè)位點(diǎn)中，有1個(gè)是堿基缺失，芯片檢測(cè)結(jié)果表明有1個(gè)在所有患者中未檢測(cè)到突變。對(duì)剩余10個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析(表3)，結(jié)果顯示rs2016520，rs316019和rs683369位點(diǎn)在群體中雜合度較大，表明這些位點(diǎn)在群體內(nèi)變異程度大。rs2016520和rs316019位點(diǎn)處于中度多態(tài)(0.25

2.3突變位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 納入研究的12個(gè)位點(diǎn)，其中rs2016520，rs12208357，rs316019和rs683369 4個(gè)位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其他位點(diǎn)可能在進(jìn)化過(guò)程中受選擇壓的影響。見(jiàn)表4。

表3 突變位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)分析

表4 位點(diǎn)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

3 討 論

基因?qū)W可明確遺傳因素對(duì)藥物效應(yīng)的影響，從而指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要意義〔16，17〕。細(xì)胞色素P450 酶基因?qū)λ幬锏难趸€原和水解起催化作用，能影響藥物的代謝速率，是重要的藥物代謝酶〔18〕。相關(guān)研究表明，血糖異常表達(dá)與P450 酶活性密切相關(guān)，P450基因敲除的模式動(dòng)物脂肪組織對(duì)葡萄糖的攝取能力增強(qiáng)，胰島素對(duì)肝糖原分解的抑制能力提高〔19〕。研究中發(fā)現(xiàn)22例有P450基因位點(diǎn)的突變，表明這些患者產(chǎn)生DM的原因可能是P450 酶活性被誘導(dǎo)，酶總含量升高，進(jìn)而所產(chǎn)生的大量活性氧(ROS)，最終造成糖代謝紊亂和血糖升高。CYP450 酶系的表達(dá)受遺傳、年齡、性別和環(huán)境等影響，患病狀態(tài)下CYP450 酶系各亞型會(huì)產(chǎn)生誘導(dǎo)和抑制，進(jìn)而導(dǎo)致藥物受到影響，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性反應(yīng)〔20〕。

許多藥物發(fā)揮作用需要基因的作用，其療效可能因?yàn)檫@些基因的突變而改變。由于二甲雙胍在體內(nèi)不與蛋白結(jié)合，不被代謝，而OCT家族基因可促進(jìn)二甲雙胍的轉(zhuǎn)運(yùn)從而使其廣泛分布在包括腸、肝臟和腎臟在內(nèi)的多個(gè)身體組織中〔21〕。如OCT1有助于將二甲雙胍轉(zhuǎn)運(yùn)入組織液，在腎小管重吸收中扮演重要角色，OCT2可促進(jìn)二甲雙胍從循環(huán)系統(tǒng)到腎小管上皮細(xì)胞中的吸收，OCT3可影響二甲雙胍在肝臟中的吸收〔22～24〕。OCTs基因突變位點(diǎn)與降糖效果顯著相關(guān)。其中OCT1基因?qū)儆谌苜|(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族，負(fù)責(zé)把二甲雙胍轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入肝細(xì)胞進(jìn)行代謝，是目前OCTs家族基因中研究最多的。如攜帶OCT1 rs622342 C位點(diǎn)的患者服用二甲雙胍后，與AA基因型患者相比糖化血紅蛋白(HbA1c)水平的降低較緩慢〔25〕。OCT l基因胞內(nèi)降解片段中的突變可影響其與許多藥物的綁定。研究納入的OCT1 rs2282143-2位點(diǎn)，在全球很多人群中都被檢測(cè)到，該突變可導(dǎo)致轉(zhuǎn)運(yùn)體活性顯著降低，但是不會(huì)徹底失活〔26〕。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，全基因組關(guān)聯(lián)分析等技術(shù)的進(jìn)步，降糖藥物相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)和克隆也取得了重大進(jìn)展。但這些基因及不同位點(diǎn)的突變?cè)诓煌N族甚至相同種族不同人群中都有很強(qiáng)的特異性?；蛐酒夹g(shù)在近幾年的基因診斷中運(yùn)用愈來(lái)愈廣泛，采用核酸分子雜交，將大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作為探針，有序且高密度地排列固定于載體上，產(chǎn)生二維 DNA 探針陣列，從而得到基因突變的信息〔27〕?；蛐酒夹g(shù)可以同時(shí)、快速、檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)，自動(dòng)化程度高。本研究成功構(gòu)建了P450酶基因和OCTs基因相關(guān)突變位點(diǎn)的芯片。