腫節(jié)風(fēng)SCAR 分子標(biāo)記克隆與驗證

羅 育 黃春喜 蔡丹昭 賀菽嘉 朱 丹

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 廣西 南寧530021； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 廣西 南寧530021； 3.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 廣西 南寧530021）

腫節(jié)風(fēng)為金粟蘭科草珊瑚屬植物草珊瑚Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai 的干燥全草，又名九節(jié)茶、草珊瑚、九接風(fēng)等，2015 年版《中國藥典》 收載其作為法定藥材［1］。腫節(jié)風(fēng)為常用中藥，其浸膏及以腫節(jié)風(fēng)作為原料的中成藥如腫節(jié)風(fēng)片、血康口服液、萬通炎康片也收載入2015 年版《中國藥典》［1］；腫節(jié)風(fēng)注射液、新癀片、三蛇膽川貝膏及糖漿則收載入部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中［2］。腫節(jié)風(fēng)作為我國傳統(tǒng)中藥材，對其相關(guān)研究主要集中在化學(xué)成分、藥理活性和臨床應(yīng)用等方面［3?5］?，F(xiàn)代藥理研究表明［6?7］，腫節(jié)風(fēng)具有抗菌、抗輻射、抗腫瘤、促進(jìn)骨折愈合及鎮(zhèn)痛等多種藥理作用，尤其在治療腫瘤（胰腺癌、胃癌、直腸癌、肝癌、食道癌等）方面具有顯著效果［8?9］，且具有較好的安全性［10］。

由于腫節(jié)風(fēng)需求量較大，市場上出現(xiàn)了雞爪蘭、金粟蘭、及己等與腫節(jié)風(fēng)功效不盡相同的混淆品，已影響腫節(jié)風(fēng)的醫(yī)療用途，降低了其藥用價值。目前，對中藥材鑒別的方法主要有理化鑒別、性狀鑒別和顯微鑒別［11?14］，若通過理化和性狀進(jìn)行鑒別，其優(yōu)點(diǎn)是方法較可靠，但缺點(diǎn)是比較費(fèi)時耗力，而若采用顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒別，其局限性較大，原因是該方法要求實驗人員有較高的鑒別能力，還要有合理的鑒別依據(jù)。相比而言，分子鑒別法鑒別中藥材，具有準(zhǔn)確性高，其技術(shù)經(jīng)培訓(xùn)后實驗人員容易掌握，經(jīng)驗性少，且省時省力的優(yōu)點(diǎn)。

目前，應(yīng)用分子鑒別法從基因水平對中藥材進(jìn)行鑒定已有報道，常用的技術(shù)主要包括DNA 條形碼技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)以及RAPD 技術(shù)等［15?19］。其中，DNA 條形碼技術(shù)是目前影響較大、應(yīng)用較廣泛的DNA 鑒定技術(shù)，主要利用種間基因序列差異來進(jìn)行物種鑒定［20］，但目前尚未有一致的植物DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)片段，也甚少應(yīng)用于對腫節(jié)風(fēng)進(jìn)行鑒定，因此需要篩選針對腫節(jié)風(fēng)基因組的特異條形碼并標(biāo)準(zhǔn)化，最終是否適用于腫節(jié)風(fēng)有待實驗驗證，這將是本課題組下一步考慮的研究。RAPD 技術(shù)是一種有助于研究新發(fā)現(xiàn)或改良物種遺傳多樣性的技術(shù)，也經(jīng)常用于藥用植物或中草藥鑒定［21?25］，但準(zhǔn)確性低，而如果通過RAPD技術(shù)獲得SCAR 分子標(biāo)記，可以提高特異性和穩(wěn)定性，雖然有時可能找不到特異的SCAR 分子標(biāo)記，且需要大量的樣本數(shù)予以支持，但因所獲得的SCAR 分子標(biāo)記可靠且易于使用，僅需PCR 和凝膠電泳便可以從電泳圖上直觀地反映鑒定結(jié)果，已被用于中草藥與其混淆品的區(qū)分，是鑒定中草藥的重要分子工具［26］。

本研究擬在分子水平上應(yīng)用RAPD 技術(shù)及SCAR 分子鑒定標(biāo)記對腫節(jié)風(fēng)進(jìn)行鑒別，以期找到能夠鑒別并區(qū)分其混淆品的特異引物，從理論上提供鑒定腫節(jié)風(fēng)的新思路，并為鑒定腫節(jié)風(fēng)及區(qū)分混淆品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 9 種腫節(jié)風(fēng)和3 種同科混淆品雞爪蘭、及己與金粟蘭來自廣西藥用植物園、廣西融水、融安及福建三明等地區(qū)，由廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為正品，具體見表1，-20 ℃條件下貯藏于廣西醫(yī)科大學(xué)103 館2 樓綜合實驗室內(nèi)。

表1 不同來源腫節(jié)風(fēng)及其部分同科植物基因組DNA 純度與濃度

1.2 方法

1.2.1 腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 提取 采用課題組前期改良CTAB 法［27］提取腫節(jié)風(fēng)基因組DNA。選取適量細(xì)嫩葉片，液氮中研碎并分裝至EP 管中。加入1.5×CTAB 及β?巰基乙醇，混勻后，65 ℃恒溫反應(yīng)30 min，12 000 r／min 離心10 min。將上層溶液吸取至另一EP 管中，加等體積氯仿／異戊醇（24 ∶1），混勻后12 000 r／min 離心10 min，吸取至另一EP 管中，加1／10 體積1×CTAB 和等體積的氯仿／異戊醇（24 ∶1），混勻后同條件離心10 min，吸取至另一EP管中，加等體積1×CTAB，混勻后65 ℃恒溫反應(yīng)30 min，同條件離心10 min，去除溶液留沉淀，加NaCl 溶解，同條件離心10 min。將溶液吸取至合適的離心管中，加2.5 倍體積無水乙醇，混勻后-20 ℃靜置15 min，同條件離心5 min，去除溶液留沉淀，70% 乙醇漂洗，同條件離心10 min，去除溶液，揮干管中殘液后加適量超純水，即得DNA 溶液，于-20 ℃下保存。

1.2.2 腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 質(zhì)量檢測 取適量DNA 提取液，上樣于1% 瓊脂糖凝膠，電泳緩沖液1×TAE，電壓100 V，電泳15 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。采用Quawell 3000 分析儀，直接讀取其A260／A280及濃度。

1.2.3 腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 進(jìn)行RAPD 擴(kuò)增［28］根據(jù)植物基因組DNA 特征，由Takara 公司提供的45 條隨機(jī)引物進(jìn)行單一引物PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系包括10×緩沖液、Mg2＋、dNTPs、胎牛血清蛋白、單一引物、Templates、rTaqDNA 聚合酶、超純水，反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性；94 ℃變性，36 ℃退火，72 ℃延伸，進(jìn)行35 個循環(huán)；最后補(bǔ)充延伸。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照電泳結(jié)果。

1.2.4 腫節(jié)風(fēng)SCAR 分子標(biāo)記膠回收 用刀片將膠塊中的目的條帶切下，放置于已滅菌的1.5 mL 離心管中，稱定質(zhì)量。按天根DNA 純化回收試劑盒說明書進(jìn)行操作，回收產(chǎn)物通過瓊脂糖凝電泳進(jìn)行檢測。

1.2.5 腫節(jié)風(fēng)SCAR 分子標(biāo)記的克隆、鑒定及測序 按照pEASY?T1 Cloning Kit（TransGen Biotech）的說明書進(jìn)行連接反應(yīng)，取3 μL 膠回收產(chǎn)物、1 μL 滅菌超純水、1 μLpEASY?T1，25 ℃保溫10 min。在上述連接產(chǎn)物中加入感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置30 min，42 ℃水浴45 s，冰上放置2 min，加入細(xì)菌培養(yǎng)基，搖床中復(fù)蘇1 h，涂于平板上，37 ℃培養(yǎng)14～16 h，采用α?互補(bǔ)篩選攜帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌。

將重組菌落制成重組菌液，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系與程序同“1.2.3” 項。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照電泳結(jié)果。

經(jīng)α?互補(bǔ)篩選及PCR 鑒定后，取陽性重組菌液置于滅菌離心管中，做好標(biāo)記并用封口膠密封，送往武漢金開瑞生物工程有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.6 腫節(jié)風(fēng)鑒定特異性引物設(shè)計 利用Vector NTI 軟件對測序進(jìn)行比對，確定4 種不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)分子標(biāo)記的同源序列，腫節(jié)風(fēng)樣本分別是廣西藥用植物園3～4 年栽培品、福建三明5 年栽培品、廣西融水4 年栽培品，按照引物設(shè)計原則［29］，使用Primer Premier 5.0 軟件獲得評分高的引物，交由公司合成。

1.2.7 腫節(jié)風(fēng)SCAR 分子標(biāo)記特異性引物驗證 以表1 中9 種腫節(jié)風(fēng)及雞爪蘭、及己與金粟蘭等3 種同科易混淆植物基因組DNA 為模板，使用自行設(shè)計引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，引物序列分別為S41?正向，5′?ATTTCCCATCCATCGTCG?3′；S41?反向，5′?CCTCCTCTTCCTGCTCCA?3′，反應(yīng)體 系包括10×緩沖液、Mg2＋、dNTPs、引物、Templates、rTaq DNA 聚合酶、超純水，反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性；94 ℃變性，53.8 ℃退火，72 ℃延伸，進(jìn)行30 個循環(huán)；最后補(bǔ)充延伸。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并拍照電泳結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 提取與質(zhì)量檢測 不同來源的腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 電泳結(jié)果見圖1。由此可知，9 種腫節(jié)風(fēng)及3 種同科易混淆植物基因組DNA 條帶清晰明亮，表明提取獲得的基因組DNA 純度較高，而且所含雜質(zhì)較少，DNA分子完整。核酸蛋白分析儀測定腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 的相關(guān)數(shù)據(jù)見表1，顯示所有樣品基因組DNA 的OD260／OD280值均在1.7～2.0 之間，質(zhì)量濃度在100～550 ng／μL 之間，表明提取到的基因組DNA 純度較高，質(zhì)量較好，可作為后續(xù)PCR 擴(kuò)增的模板。

圖1 不同來源腫節(jié)風(fēng)及部分同科植物基因組DNA電泳結(jié)果

2.2 腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 進(jìn)行RAPD 擴(kuò)增 從S41號隨機(jī)引物擴(kuò)增的結(jié)果中獲得SCAR 片段，見圖2，顯示4 種不同產(chǎn)地的腫節(jié)風(fēng)樣本RAPD 擴(kuò)增后出現(xiàn)一致片段（1 000～2 000 bp），重復(fù)擴(kuò)增均有相同的結(jié)果。因其片段大小適中，故可以篩選作為SCAR 分子標(biāo)記。

圖2 4 種不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)RAPD 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 菌液PCR 鑒定 α?互補(bǔ)篩選出陽性克隆菌落后，PCR擴(kuò)增陽性克隆菌落進(jìn)行鑒定，見圖3。由此可知，在1 000～2 000 bp 之間均出現(xiàn)了擴(kuò)增條帶，且是唯一的條帶，大小與圖2 一致，清晰明亮，表明S41引物擴(kuò)增獲得的SCAR 分子標(biāo)記已成功插入pEASY?T載體中，克隆完成。

2.4 特異性引物鑒定 采用測序合并Vector NTI 軟件分析SCAR 分子鑒定標(biāo)記的堿基序列，長度為1 352 bp（GenBank 登記號為MN244913），此序列作為模板設(shè)計出鑒別引物，擴(kuò)增9 種不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)及3 種同科混淆品雞爪蘭、及己與金粟蘭等基因組DNA，見圖4。由此可知，9 種腫節(jié)風(fēng)均出現(xiàn)有唯一條帶（大小約為500 bp），并與預(yù)期擴(kuò)增長度相符；3 種同科混淆品沒有擴(kuò)增條帶，因為該引物是從腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 的堿基序列中獲得，也說明其屬于腫節(jié)風(fēng)與同科植物的鑒別引物。同時，獲得了一種新的可進(jìn)行腫節(jié)風(fēng)鑒別的SCAR 分子標(biāo)記。

圖3 菌液PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖4 9 種不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)及3 種同科混淆品特異引物擴(kuò)增

3 討論

中草藥等藥用植物因其自身次生代謝物較復(fù)雜，提取基因組DNA 相對較為困難，若其中的次生代謝物不能有效去除，必將會影響到后續(xù)的PCR 擴(kuò)增；本研究前期使用試劑盒提取腫節(jié)風(fēng)基因組DNA，雖電泳檢測時能看到完整的DNA 條帶，但其A260／A280比值較差，均不在1.7～2.0 范圍，后續(xù)的PCR 擴(kuò)增也得不到穩(wěn)定的條帶。鑒于此，本研究選擇了CTAB 法并加以改良，最終獲得完整、高質(zhì)量的腫節(jié)風(fēng)及其他科植物基因組DNA，并能用于后續(xù)的PCR 擴(kuò)增。

本研究在解決了基因組DNA 質(zhì)量的基礎(chǔ)上，通過隨機(jī)引物獲得腫節(jié)風(fēng)RAPD 標(biāo)記，克隆并篩選轉(zhuǎn)化為SCAR 標(biāo)記，與GenBank 上其他物種植物基因組DNA 序列進(jìn)行比對，顯示同源性較低，表明其屬于腫節(jié)風(fēng)基因組DNA 中的特有序列；以此SCAR 標(biāo)記為模板設(shè)計鑒別引物，PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示對9 種不同產(chǎn)地腫節(jié)風(fēng)樣本的DNA 具有特異性，而在其他同科植物的DNA 中沒有PCR 擴(kuò)增結(jié)果，表明篩選到了可用于腫節(jié)風(fēng)鑒別的特異性SCAR 分子標(biāo)記，因此結(jié)合RAPD 和SCAR2 種分子標(biāo)記技術(shù)，以期建立一種可以對腫節(jié)風(fēng)與其混淆品鑒別的方法，為藥用植物以及其他植物物種的遺傳特性與鑒別提供參考。