對葉百部總生物堿對辣椒素致豚鼠咳嗽的影響

楊丹丹 許立拔 夏 星 吳思宇 王孝勛? 梁瓊月

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西 南寧530200； 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥重點實驗室， 廣西 南寧530200）

咳嗽是臨床上很多疾病的癥狀，可由外源性或內(nèi)源性刺激物刺激呼吸道黏膜，造成許多神經(jīng)肽的釋放，神經(jīng)肽刺激感受器引起神經(jīng)沖動，刺激咳嗽中樞，大腦皮質(zhì)控制性失衡而產(chǎn)生咳嗽［1］?？人允菣C體一種重要的防御反射，可清除呼吸道異物，但頻繁劇烈或長時間的咳嗽會給患者工作、生活帶來嚴(yán)重影響?！稘婪健た人浴罚骸拔迮K六腑皆令人咳，非獨肺也”，中醫(yī)認(rèn)為咳嗽 “必自肺而穿五臟”，五臟六腑功能失調(diào)，導(dǎo)致邪客于肺，均可引發(fā)咳嗽，故其病因很復(fù)雜［2］。

對葉百部為百部科植物對葉百部Stemona tuberosaLour.的干燥塊根，有潤肺下氣止咳、殺蟲滅虱之功效。課題組前期研究表明，廣西不同產(chǎn)地對葉百部總生物堿對小鼠均有止咳作用，但具體機制尚不明確［3］。本實驗考察對葉百部總生物堿對辣椒素致豚鼠咳嗽的影響，以期為相關(guān)新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 Dunkin Hartley 種白化豚鼠（DH 豚鼠），普通級，雌雄各半，雌性體質(zhì)量251.1～323.8 g，雄性體質(zhì)量293.8～392.4 g，由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2014?0010，動物室符合普通級要求。

1.2 試劑與藥物 對葉百部總生物堿由廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯瑤藥重點實驗室提供，酸性染料比色法測得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為82.15%。磷酸可待因（青海制藥廠有限公司，批號20160915）；辣椒素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號G1502115）；羧甲基纖維素鈉（CMC?Na，國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20160704）；磷酸鹽緩沖液（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號20171012）；水合氯醛（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號2017091901）；4% 多聚甲醛（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號201803）；豚鼠P 物質(zhì)（SP）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20180627）。

1.3 儀器 KQ?500DA 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；5810R 型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；RCT B 型磁力攪拌器（德國IKA 公司）；BSA224S 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；SIM?F140AY65?PC 型制冰機（日本大阪松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社）；FJ?200 型分散均質(zhì)機（上海標(biāo)本模型廠）；WH?2000型超聲波霧化器（廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司）；Infinite M200pro 型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）。

2 方法

2.1 對葉百部總生物堿制備 稱取對葉百部粉末（過二號篩）1 kg，置于具塞錐形瓶中，精密加入10 L 甲醇超聲40 min，放冷，搖勻，濾過，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干溶劑，殘渣加2 500 mL 4% 鹽酸溶解，抽濾，濾去酸不溶性成分，濾液加氨水調(diào)至pH 9～10，析出沉淀，將沉淀與溶液一起移至分液漏斗，加4 L 氯仿萃取，取下層氯仿層清液，揮干溶劑，即得對葉百部總生物堿。取140 mg，研磨成細(xì)粉后加0.5% CMC?Na 至10 mL，充分混勻成混懸液，即得高劑量藥液（14.0 mg／mL），同法配制低、中劑量藥液（3.5、7.0 mg／mL），臨用現(xiàn)配，給藥時用磁力攪拌器充分混勻。

2.2 分組、造模與給藥 60 只豚鼠隨機分為正常組，模型組，對葉百部總生物堿低、中、高劑量組（5、10、20 mg／kg），磷酸可待因片組（10 mg／kg）［4］，每組10 只，按1.4 mL／kg 劑量灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)3 d，正常組、模型組給予等體積0.5%CMC?Na 溶液。記錄給藥前及給藥結(jié)束豚鼠體質(zhì)量，并計算其增長值。

2.3 咳嗽指標(biāo) 豚鼠禁食不禁水12～14 h，末次給藥后1 h先將超聲波霧化器連接5 L（直徑20 cm，高16 cm）帶硅膠蓋的密閉透明三角玻璃燒瓶罩中，開動霧化器調(diào)節(jié)到0.5 mL／min，使玻璃罩內(nèi)充滿霧化0.03 mol／L 辣椒素，除正常組不做任何處理外，其余各組豚鼠放入玻璃罩內(nèi)，每個罩子1 只，繼續(xù)噴霧120 s，記錄10 min 內(nèi)豚鼠咳嗽次數(shù)（咳嗽聲響亮?xí)r進行）［5］，計算鎮(zhèn)咳率，公式為鎮(zhèn)咳率＝［（模型組咳嗽次數(shù)-給藥組咳嗽次數(shù)）／模型組咳嗽次數(shù)］×100%。

2.4 采血與取材 檢測咳嗽指標(biāo)后，所有豚鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL／kg）麻醉，腹主動脈采血，4 ℃、3 000 r／min 下離心20 min，分離血清，分裝凍存。采血后分離氣管，肺左下葉置于4% 多聚甲醛中固定，HE 染色，用于組織病理學(xué)檢測；同一部位分離肺右下葉組織100 mg，按1 ∶5 比例加入PBS 緩沖液（pH ＝7.4），迅速勻漿，4 ℃、3 000 r／min 下離心20 min，分離上清液，分裝凍存［6］。ELISA 法檢測血清及肺組織SP 水平，具體操作按試劑盒說明書進行；酶標(biāo)儀在450 nm 波長處檢測吸光度（OD），擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算結(jié)果。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS21.0 軟件進行處理，計量數(shù)據(jù)以（ˉ）表示，若符合正態(tài)分布和方差齊性，多組間比較采用單因素方差檢驗，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；若不符合正態(tài)分布或方差齊性，多組間比較采用秩和檢驗，組間兩兩比較采用Mann?Whitney U 檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對葉百部總生物堿對豚鼠體質(zhì)量的影響 表1 顯示，給藥3 d 后與正常組比較，模型組豚鼠體質(zhì)量及其增長程度均無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠體質(zhì)量及其增長程度均無明顯差異（P＞0.05）。

表1 對葉百部總生物堿對豚鼠體質(zhì)量的影響（， n＝10）

表1 對葉百部總生物堿對豚鼠體質(zhì)量的影響（， n＝10）

3.2 對葉百部總生物堿對咳嗽指標(biāo)的影響 表2 顯示，與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠咳嗽次數(shù)均減少（P＜0.01），高劑量組咳嗽潛伏期延長（P＜0.05），并且鎮(zhèn)咳率與劑量呈正比。

表2 對葉百部總生物堿對咳嗽指標(biāo)的影響（， n＝10）

表2 對葉百部總生物堿對咳嗽指標(biāo)的影響（， n＝10）

注：與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.3 對葉百部總生物堿對豚鼠血清和肺組織SP 水平的影響 表3 顯示，與正常組比較，模型組豚鼠血清和肺組織SP 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠血清和肺組織SP 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3.4 對葉百部總生物堿對豚鼠氣管組織病理改變的影響圖1 顯示，正常組豚鼠氣管黏膜光滑，含有杯狀細(xì)胞和纖毛細(xì)胞的假復(fù)層纖毛柱狀上皮，未見增厚或水腫，管腔光滑；模型組豚鼠氣管黏膜上皮明顯增厚，表面粗糙，有腫脹突起；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠氣管黏膜增厚明顯改善，表面較光滑，腫脹明顯消除。

3.5 對豚鼠肺組織病理改變的影響 圖2 顯示，正常組豚鼠肺泡壁薄，排列整齊，邊界清晰；模型組豚鼠出現(xiàn)肺實變，肺泡明顯萎陷，肺泡擠壓，邊界不清晰；與模型組比較，對葉百部總生物堿各劑量組豚鼠肺實變明顯改善，肺泡萎陷明顯改善，邊界較清晰，擠壓程度明顯減輕。

表3 對葉百部總生物堿對豚鼠血清和肺組織SP 水平的影響（， n＝10）

表3 對葉百部總生物堿對豚鼠血清和肺組織SP 水平的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

圖1 各組豚鼠氣管組織病理改變（HE，×400）

圖2 各組豚鼠肺組織病理改變（HE，×400）

4 討論

咳嗽病名最開始記載于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，是一種常見的臨床癥狀。中醫(yī)認(rèn)為，咳嗽是因肺失清輕或肅降致肺氣上逆所致，《靈樞經(jīng).九針論》 曰：“五臟氣，肺主咳”，咳嗽病因復(fù)雜，五臟的病變皆可引起咳嗽。百部用于咳嗽治療，始載于陶景洪的《名醫(yī)別錄》：“白并，味苦無毒。主治肺咳上氣，行五臟，令百病不起”。白并即為百部，常用于咳嗽、外感、內(nèi)傷、暴咳、久嗽等的治療，為治療肺癆之要藥，對急慢性及各種原因產(chǎn)生的咳嗽，均可治療，能行五臟，令百病不起，應(yīng)該是百部可用于治療各種原因引起咳嗽的主要作用機制。現(xiàn)代研究表明，對葉百部有抗肺炎支原體［7］、抗氧化［8］、中樞鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、止咳化痰［9］、抗菌、殺蟲［10］等，可能是對葉百部止咳的相關(guān)機制，而對葉百部總生物堿是其發(fā)揮藥效作用的主要成分［3］。

辣椒素是一種咳嗽刺激劑，主要通過刺激C 纖維受體來引咳。辣椒素刺激氣管黏膜疼痛、微循環(huán)增加及支氣管痙攣，導(dǎo)致局部血漿滲出、血管擴張及水腫，激發(fā)Ca2＋為主的陽離子內(nèi)流，促進SP 和炎癥趨化因子釋放，引發(fā)肺和氣管神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)［11］。辣椒素致神經(jīng)源性炎癥的主要神經(jīng)遞質(zhì)是SP，SP 是具有多種生物活性的11 肽，可直接刺激感覺神經(jīng)末梢介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥，引起支氣管平滑肌收縮、血漿滲出、黏液分泌增加、炎癥介質(zhì)釋放增加、血管通透性增加及氣道上皮損傷或脫落［12?13］。本實驗結(jié)果表明，辣椒素可引起豚鼠明顯咳嗽次數(shù)增多，血清和肺組織SP 水平顯著升高，氣管黏膜上皮明顯增厚，表面粗糙及水腫，肺實化，肺泡明顯萎陷，表明辣椒素復(fù)制的豚鼠咳嗽模型成功。

對葉百部總生物堿可顯著減少辣椒素所致豚鼠咳嗽次數(shù)及延長咳嗽潛伏期，顯著降低血清和肺組織SP 水平，明顯減輕氣管上皮和肺泡的損傷，這可能與對葉百部總生物堿可行五臟，減少SP 的產(chǎn)生和體內(nèi)的蓄積，減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)，其鎮(zhèn)咳作用也可能與其中樞性鎮(zhèn)咳作用有關(guān)［9］。對葉百部總生物堿有明顯的拮抗辣椒素致的咳嗽作用，其機制可能與減輕辣椒素對呼吸系統(tǒng)的損傷和抑制神經(jīng)肽SP 產(chǎn)生及表達有關(guān)。