金銀花木樨草苷對(duì)大鼠抑郁及中樞海馬神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控的影響

趙 孟 王玉婷 戢漢斌?

［1.武漢市武東醫(yī)院）武漢市第二精神病醫(yī)院）， 湖北 武漢430084； 2.武漢大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心， 湖北武漢430072］

抑郁癥是一種持續(xù)的心境低落，甚至有自殘、自殺等行為的精神疾病，有研究認(rèn)為其與遺傳、外界環(huán)境應(yīng)激等相關(guān)［1］，但具體的病理機(jī)制尚不明確。臨床報(bào)道顯示抑郁癥患者外周血中5?羥色胺（5?HT）和多巴胺（DA）等神經(jīng)遞質(zhì)的水平是顯著降低的，因此大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)失衡，如5?HT、DA、NE 下調(diào)可能是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的主要原因［2?3］。目前，臨床上抗抑郁治療的一線藥物是氟西汀，作為選擇性5?HT 再攝取抑制劑，它能通過抑制突觸間隙對(duì)5?HT 的再攝快速逆轉(zhuǎn)中樞及外周單胺遞質(zhì)水平的失衡；但不足的是患者服藥治療后抑郁癥狀緩解相對(duì)滯后［4?5］，這表明不僅單胺遞質(zhì)參與了抑郁的生理病理過程，其他因子可能也參與其中。在長(zhǎng)期應(yīng)激刺激下，機(jī)體下丘腦?垂體?腎上腺皮質(zhì)HPA 軸功能持續(xù)亢進(jìn)，由于海馬神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）水平下調(diào)，海馬結(jié)構(gòu)和功能隨之發(fā)生改變［6］，這可能使抑郁進(jìn)一步加劇。因此，從天然產(chǎn)物中尋找治療神經(jīng)精神類疾病的活性單體物質(zhì)，彌補(bǔ)現(xiàn)有藥物療效的不足，探討相關(guān)的作用機(jī)制是近年來中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)。

金銀花lonicera japonica屬于忍冬科科植物，自古就被譽(yù)為清熱解毒的良藥。研究表明金銀花醇提物中富含大量黃酮類物質(zhì)，其中最主要的成分就是木樨草苷（cy?narosid）［7?8］，它可通過血腦屏障，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等生理功效。然而，金銀花木樨草苷對(duì)中樞系統(tǒng)神經(jīng)退行性精神疾病是否有改善作用，能否逆轉(zhuǎn)單胺遞質(zhì)失衡，緩解海馬結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，治療抑郁尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本文將探究金銀花木樨草苷對(duì)大鼠抑郁行為的改善作用，并探討其是否通過調(diào)節(jié)海馬BDNF 表達(dá)及單胺遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮抗抑郁作用。

本研究通過慢性不可預(yù)知性應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)法構(gòu)建大鼠抑郁模型，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)估藥物治療前后大鼠行為學(xué)的改變；高效液相?熒光分析法測(cè)定中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水 平，Western blot 和RT?PCR 測(cè) 定BDNF 蛋白及mRNA 的表達(dá)，初步探討金銀花木樨草苷抗抑郁作用機(jī)制，為后續(xù)單體活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠48 只，體質(zhì)量180～200 g ［湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（湘）2011?0003］，自由覓食、飲水，飼養(yǎng)于自然光暗周期的環(huán)境中。

1.2 試劑與藥物 金銀花（亳州市雙寶中藥材有限公司，一等品）。羧甲基纖維素鈉、鹽酸氟西汀片（批號(hào)2079A）購自禮來蘇州制藥有限公司。木樨草苷、5?羥色胺（5?HT）、去甲腎上腺素（NE）、多巴胺（DA）均購自美國(guó)Sigma 公司；BDNF 引物由美國(guó)Invitrogen 公司合成，TRIzol總RNA 提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；cDNA Kit 合成試劑盒購自羅氏公司。氟西汀、金銀花木樨草苷用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液現(xiàn)配成混懸液。

1.3 儀器 HH?600 水浴鍋（科華儀器有限公司）；HPLC高效液相色譜儀（日本島津公司）；ANTEC 熒光檢測(cè)器（荷蘭安泰克公司）。

2 方法

2.1 金銀花木樨草苷的提取 將文獻(xiàn)方法略微調(diào)整，醇提金銀花木樨草苷［7?8］。將金銀花花瓣粉碎，取50 g 溶于500 mL 70% 乙醇中浸泡24 h，75 ℃回流提取3 h，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味，蒸餾水配成1 g／mL 醇提物，混合液經(jīng)101 大孔樹脂分離得到粗提液，收集后經(jīng)HPLC 測(cè)定其含有量。分析采用Cosmosil π?NAP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），梯度洗脫（0～15 min，甲醇∶ 0.4%H3PO4＝1 ∶ 9；15～40 min，甲醇∶0.4% H3PO4＝2 ∶8；40 min 后，甲 醇 ∶ 0.4% H3PO4＝3 ∶ 7）；體積流 量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波 長(zhǎng)350 nm；進(jìn)樣量20 μL。

將濃縮液干燥成膏（棕褐色，每1 g 生藥含木樨草苷4.74 mg），生理鹽水溶解，配成高、中、低3 個(gè)劑量，即100、50、25 mg／kg。

2.2 分組、造模及給藥

2.2.1 分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后禁水不禁食24 h，然后給予1%蔗糖水，測(cè)定1 h 內(nèi)消耗量。選擇48 只攝入量相近的大鼠，隨機(jī)分空白組、模型組、氟西汀組、金銀花木樨草苷組（100、50、25 mg／kg），每組8 只。

2.2.2 造模 空白組大鼠采用合籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境室溫（24±1）℃，相對(duì)濕度（60±10）%，正常進(jìn)食飲水，不給予任何刺激，其余組采用CUMS 結(jié)合孤養(yǎng)法構(gòu)建大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型，每籠飼養(yǎng)1 只，連續(xù)4 周每天下午15：00 給予2 種不同的刺激，包括晝夜顛倒（24 h）、禁食（24 h）、禁水（24 h）、4 ℃冰水游 泳（5 min）、45 ℃熱 烘（5 min）、潮濕飼養(yǎng)（潮濕墊料）［9?10］。于實(shí)驗(yàn)前后對(duì)6 組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，評(píng)估抑郁癥狀、造模是否成功。

2.2.3 給藥 實(shí)驗(yàn)邊造模邊給藥，每天上午10：00 灌胃1次?？瞻捉M和模型組均給予0.5% 羧甲基纖維素鈉混懸液（10 mL／kg），鹽酸氟西汀組給予0.5% 羧甲基纖維素鈉配制的氟西汀懸浮液（2 mg／kg），金銀花木樨草苷高、中、低組則分別給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的金銀花木樨草苷懸浮液（100、50、25 mg／kg），連續(xù)4 周。末次給藥后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，評(píng)估完成后進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.3 行為學(xué)評(píng)估 于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)開始第28 天灌胃給藥后1 h，進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，評(píng)估各組大鼠行為狀態(tài)。

2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［9?10］，將各組大鼠放入5×5 的25 格紙箱中（100 cm×100 cm），記錄5 min 內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況（直立次數(shù)、水平穿過格數(shù)），直立次數(shù)以雙前爪同時(shí)抬起為準(zhǔn)，以3 只以上爪同時(shí)在1 個(gè)格子為穿越1 個(gè)水平格子。

2.3.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9?10］，用膠帶黏住大鼠尾端2 cm 的部位，懸掛在距離桌面50 cm 的架子上，頭朝下，前后左右均無攀抓物，一段時(shí)間后大鼠活動(dòng)減少，觀察6 min 的活動(dòng)情況，大鼠靜止垂直倒懸的時(shí)間為懸尾不動(dòng)時(shí)間，其中前1 min 不作記錄，記錄后5 mim 內(nèi)時(shí)間。

2.3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［9?10］，將大鼠置于一個(gè)透明容器內(nèi)（高度為60 cm，直徑為25 cm），保持水位為30 cm，水溫為（25±2）℃。觀察大鼠6 min 的行為狀況，記錄后5 min 內(nèi)游泳不動(dòng)時(shí)間（大鼠在水上漂浮沒有四肢的掙扎，偶爾移動(dòng)僅是保持頭部露在水面以上）。

2.4 高效液相?熒光法（HPLC?F）測(cè)定大鼠海馬單胺遞質(zhì)水平 于實(shí)驗(yàn)第28 天完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，斷頭處死各組大鼠，迅速在冰上剝離大腦，取出海馬組織，稱量后置組織冷凍管中，液氮快速冷凍備用。稱取一定量的海馬組織，加入適量預(yù)冷的0.1 mol／L 過氯酸（含0.3 mmol／L EDTA二鈉和0.5 mmol／L 亞硫酸鈉），冰水浴中超聲勻漿，4 ℃避光靜置一段時(shí)間后10 000 r／mim 離心10 min，取上清液過濾后，HPLC?F 測(cè)定單胺遞質(zhì)水平，取20 μL 過濾液自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定。條件為Diammonsilim C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相100 mmol／L 枸櫞酸?檸檬酸鈉緩沖液（pH ＝4.0），0.1 mmol／L EDTA，16% 甲醇；體積流量0.8 mL／min；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)254 nm，發(fā)射波長(zhǎng)340 nm，單胺遞質(zhì)水平單位以ng／g 表示。

2.5 RT?PCR 檢測(cè) 稱取各組大鼠海馬50 mg，采用TRIzol法提取總RNA，然后將1 μg 總RNA 通過cDNA Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR 在LightCycler＠480（Roche 公司）設(shè)備中進(jìn)行，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，并以GAPDH作為內(nèi)參，定量PCR 特異產(chǎn)物通過溶解曲線分析，以2-ΔΔct表示相對(duì)基因表達(dá)變化，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 金銀花木樨草苷含有量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)方法提取分離金銀花木樨草苷，并采用HPLC 進(jìn)行含有量測(cè)定［7?8］，根據(jù)對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，mg／mL）和峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得方程為Y＝323.86X-61.62（r＝0.999）。由圖1A 可知，木樨草苷色譜峰保留時(shí)間為25 min，1 g／mL 金銀花醇提物經(jīng)大孔樹脂分離后，其質(zhì)量濃度為4.74 mg／mL。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

3.2 金銀花木樨草苷對(duì)抑郁大鼠行為學(xué)的影響 如表2 所示，實(shí)驗(yàn)前各組大鼠水平和垂直自主活動(dòng)量相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；4 周后，模型組大鼠水平穿越格數(shù)和直立次數(shù)較空白組降低（P＜0.05）；給予氟西汀和金銀花木樨草苷干預(yù)后，大鼠水平穿格數(shù)和直立次數(shù)與模型組比較增加（P＜0.05），且金銀花木樨草苷對(duì)抑郁大鼠自主活動(dòng)的改善作用隨著給藥劑量升高而增加，其療效接近陽性藥氟西汀。

表2 各組大鼠水平方向運(yùn)動(dòng)格數(shù)和直立次數(shù)（， n＝8）

表2 各組大鼠水平方向運(yùn)動(dòng)格數(shù)和直立次數(shù)（， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

由表3 可知，實(shí)驗(yàn)前各組大鼠懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間非常接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)過4 周慢性應(yīng)激刺激造模后，模型組大鼠懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.05）；給予氟西汀和金銀花木樨草苷后，懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間減少（P＜0.05），不動(dòng)時(shí)間縮短了30～50 s，大鼠抑郁不動(dòng)狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，且高劑量組效果更優(yōu)，呈現(xiàn)劑量依賴性。

3.3 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)單胺遞質(zhì)水平的影響 圖2A 為神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5?HT 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖，峰保留時(shí)間分別為4.85、5.35、7.25 min，分離度良好?？瞻捉M海馬組織色譜圖如圖2B 所示，分別在5.0、5.5、7.5 min檢測(cè)到NE、DA、5?HT。各組大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含有量測(cè)定結(jié)果見圖2C，與空白組比較模型組大鼠海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水平降低（P＜0.05）；藥物干預(yù)后，各組大鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平與模型組相比有大幅回升（P＜0.05），其中氟西汀組更明顯，金銀花木樨草苷高劑量組次之，療效與給藥劑量有關(guān)。

3.4 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)BDNF 蛋白和mRNA 表達(dá)的影響 如圖3 所示，與空白組相比，模型組海馬區(qū)BDNF 蛋白和mRNA 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；氟西汀和金銀花木樨草苷能改善大鼠抑郁行為，還能使海馬區(qū)BDNF 蛋白、mRNA 表達(dá)上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

近年來，中醫(yī)藥發(fā)展迅速，從天然產(chǎn)物中提取有效活性單體治療相關(guān)疾病成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文探究了金銀花木犀草苷對(duì)抑郁大鼠行為狀態(tài)的影響，結(jié)果證實(shí)了其良好的抗抑郁作用。大鼠經(jīng)過4 周慢性不可預(yù)知性應(yīng)激后，自主活動(dòng)量較空白組明顯減少，懸尾及游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加。這一結(jié)果和鄧海峰等人的研究一致［10］，在不良應(yīng)激源刺激下，大鼠自主活動(dòng)減少，興趣喪失，長(zhǎng)期處于呆滯狀態(tài)，絕望無助的表現(xiàn)與臨床抑郁癥患者精神運(yùn)動(dòng)性抑制、興趣缺失等癥狀相同。給予金銀花木樨草苷和氟西汀治療后，大鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中自主活動(dòng)明顯增加，懸尾及游泳不動(dòng)時(shí)間縮短，證明了金銀花木樨草苷能改善動(dòng)物的抑郁行為，具有一定的抗抑郁作用。

表3 各組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間和游泳不動(dòng)時(shí)間（， n＝8）

表3 各組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間和游泳不動(dòng)時(shí)間（， n＝8）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05。

圖2 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)單胺遞質(zhì)水平的影響

圖3 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)BDNF 表達(dá)的影響

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制假說眾多，其中單胺遞質(zhì)假說和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說得到廣泛認(rèn)可。單胺遞質(zhì)假說提出抑郁癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5?HT、NE、DA 的缺乏。大腦5?HT 系統(tǒng)、NE 系統(tǒng)和DA 系統(tǒng)參與了睡眠和情緒等生理活動(dòng)的調(diào)控過程，而神經(jīng)遞質(zhì)的改變將直接或間接影響相關(guān)受體功能，5?HT 等水平低下的人群易產(chǎn)生抑郁情緒或行為［11］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中的神經(jīng)遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水平顯著下調(diào)，這和王含彥等人的報(bào)道相符［12］，在慢性應(yīng)激刺激下，大鼠中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)水平減少，相關(guān)受體功能紊亂，進(jìn)而產(chǎn)生抑郁樣行為。海馬區(qū)是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，對(duì)情緒、學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)控有著重要生理作用，臨床報(bào)道顯示抑郁癥患者海馬部位的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生了明顯改變［13］。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說認(rèn)為［14?16］，海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變是由于海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，BDNF 具有神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡作用，其水平升高有助于抑制海馬神經(jīng)元的凋亡。研究表明［17?18］，單胺遞質(zhì)系統(tǒng)與BDNF 的表達(dá)密切相關(guān)，5?HT 等遞質(zhì)可以調(diào)節(jié)其表達(dá)，反之BDNF 也可以保護(hù)5?HT 等神經(jīng)元，促進(jìn)突觸生長(zhǎng)，增加突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)的含量。和空白組比較，模型組大鼠海馬區(qū)DBNF 蛋白和mRNA 表達(dá)顯著降低。金銀花木犀草苷可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激刺激導(dǎo)致的海馬單胺遞質(zhì)水平的下降，給藥組大鼠海馬區(qū)5?HT、NE 和DA 水平顯著升高，同時(shí)BDNF 蛋白及mRNA 表達(dá)也明顯增加，說明金銀花木犀草苷可能是通過上調(diào)海馬區(qū)BDNF 表達(dá)量，逆轉(zhuǎn)海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變，減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，從而調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮抗抑郁療效，且高劑量組抗抑郁效果優(yōu)于低劑量組。

綜上所述，金銀花木樨草苷可逆轉(zhuǎn)并改善慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為，其可能的機(jī)制是上調(diào)海馬BDNF 表達(dá)，增加中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平。