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    金銀花木樨草苷對(duì)大鼠抑郁及中樞海馬神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控的影響

    2020-11-02 13:14:34王玉婷戢漢斌
    中成藥 2020年10期
    關(guān)鍵詞:懸尾單胺木樨

    趙 孟 王玉婷 戢漢斌?

    [1.武漢市武東醫(yī)院)武漢市第二精神病醫(yī)院), 湖北 武漢430084; 2.武漢大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心, 湖北武漢430072]

    抑郁癥是一種持續(xù)的心境低落,甚至有自殘、自殺等行為的精神疾病,有研究認(rèn)為其與遺傳、外界環(huán)境應(yīng)激等相關(guān)[1],但具體的病理機(jī)制尚不明確。臨床報(bào)道顯示抑郁癥患者外周血中5?羥色胺(5?HT)和多巴胺(DA)等神經(jīng)遞質(zhì)的水平是顯著降低的,因此大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)失衡,如5?HT、DA、NE 下調(diào)可能是導(dǎo)致抑郁發(fā)生的主要原因[2?3]。目前,臨床上抗抑郁治療的一線藥物是氟西汀,作為選擇性5?HT 再攝取抑制劑,它能通過抑制突觸間隙對(duì)5?HT 的再攝快速逆轉(zhuǎn)中樞及外周單胺遞質(zhì)水平的失衡;但不足的是患者服藥治療后抑郁癥狀緩解相對(duì)滯后[4?5],這表明不僅單胺遞質(zhì)參與了抑郁的生理病理過程,其他因子可能也參與其中。在長(zhǎng)期應(yīng)激刺激下,機(jī)體下丘腦?垂體?腎上腺皮質(zhì)HPA 軸功能持續(xù)亢進(jìn),由于海馬神經(jīng)元腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)水平下調(diào),海馬結(jié)構(gòu)和功能隨之發(fā)生改變[6],這可能使抑郁進(jìn)一步加劇。因此,從天然產(chǎn)物中尋找治療神經(jīng)精神類疾病的活性單體物質(zhì),彌補(bǔ)現(xiàn)有藥物療效的不足,探討相關(guān)的作用機(jī)制是近年來中醫(yī)藥研究的熱點(diǎn)。

    金銀花lonicera japonica屬于忍冬科科植物,自古就被譽(yù)為清熱解毒的良藥。研究表明金銀花醇提物中富含大量黃酮類物質(zhì),其中最主要的成分就是木樨草苷(cy?narosid)[7?8],它可通過血腦屏障,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等生理功效。然而,金銀花木樨草苷對(duì)中樞系統(tǒng)神經(jīng)退行性精神疾病是否有改善作用,能否逆轉(zhuǎn)單胺遞質(zhì)失衡,緩解海馬結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙,治療抑郁尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此,本文將探究金銀花木樨草苷對(duì)大鼠抑郁行為的改善作用,并探討其是否通過調(diào)節(jié)海馬BDNF 表達(dá)及單胺遞質(zhì)系統(tǒng)發(fā)揮抗抑郁作用。

    本研究通過慢性不可預(yù)知性應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)結(jié)合孤養(yǎng)法構(gòu)建大鼠抑郁模型,采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)估藥物治療前后大鼠行為學(xué)的改變;高效液相?熒光分析法測(cè)定中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水 平,Western blot 和RT?PCR 測(cè) 定BDNF 蛋白及mRNA 的表達(dá),初步探討金銀花木樨草苷抗抑郁作用機(jī)制,為后續(xù)單體活性物質(zhì)的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

    1 材料

    1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠48 只,體質(zhì)量180~200 g [湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2011?0003],自由覓食、飲水,飼養(yǎng)于自然光暗周期的環(huán)境中。

    1.2 試劑與藥物 金銀花(亳州市雙寶中藥材有限公司,一等品)。羧甲基纖維素鈉、鹽酸氟西汀片(批號(hào)2079A)購自禮來蘇州制藥有限公司。木樨草苷、5?羥色胺(5?HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)均購自美國(guó)Sigma 公司;BDNF 引物由美國(guó)Invitrogen 公司合成,TRIzol總RNA 提取試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;cDNA Kit 合成試劑盒購自羅氏公司。氟西汀、金銀花木樨草苷用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液現(xiàn)配成混懸液。

    1.3 儀器 HH?600 水浴鍋(科華儀器有限公司);HPLC高效液相色譜儀(日本島津公司);ANTEC 熒光檢測(cè)器(荷蘭安泰克公司)。

    2 方法

    2.1 金銀花木樨草苷的提取 將文獻(xiàn)方法略微調(diào)整,醇提金銀花木樨草苷[7?8]。將金銀花花瓣粉碎,取50 g 溶于500 mL 70% 乙醇中浸泡24 h,75 ℃回流提取3 h,提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味,蒸餾水配成1 g/mL 醇提物,混合液經(jīng)101 大孔樹脂分離得到粗提液,收集后經(jīng)HPLC 測(cè)定其含有量。分析采用Cosmosil π?NAP C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),梯度洗脫(0~15 min,甲醇∶ 0.4%H3PO4=1 ∶ 9;15~40 min,甲醇∶0.4% H3PO4=2 ∶8;40 min 后,甲 醇 ∶ 0.4% H3PO4=3 ∶ 7);體積流 量1.0 mL/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波 長(zhǎng)350 nm;進(jìn)樣量20 μL。

    將濃縮液干燥成膏(棕褐色,每1 g 生藥含木樨草苷4.74 mg),生理鹽水溶解,配成高、中、低3 個(gè)劑量,即100、50、25 mg/kg。

    2.2 分組、造模及給藥

    2.2.1 分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后禁水不禁食24 h,然后給予1%蔗糖水,測(cè)定1 h 內(nèi)消耗量。選擇48 只攝入量相近的大鼠,隨機(jī)分空白組、模型組、氟西汀組、金銀花木樨草苷組(100、50、25 mg/kg),每組8 只。

    2.2.2 造模 空白組大鼠采用合籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)環(huán)境室溫(24±1)℃,相對(duì)濕度(60±10)%,正常進(jìn)食飲水,不給予任何刺激,其余組采用CUMS 結(jié)合孤養(yǎng)法構(gòu)建大鼠慢性應(yīng)激抑郁模型,每籠飼養(yǎng)1 只,連續(xù)4 周每天下午15:00 給予2 種不同的刺激,包括晝夜顛倒(24 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、4 ℃冰水游 泳(5 min)、45 ℃熱 烘(5 min)、潮濕飼養(yǎng)(潮濕墊料)[9?10]。于實(shí)驗(yàn)前后對(duì)6 組大鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,評(píng)估抑郁癥狀、造模是否成功。

    2.2.3 給藥 實(shí)驗(yàn)邊造模邊給藥,每天上午10:00 灌胃1次??瞻捉M和模型組均給予0.5% 羧甲基纖維素鈉混懸液(10 mL/kg),鹽酸氟西汀組給予0.5% 羧甲基纖維素鈉配制的氟西汀懸浮液(2 mg/kg),金銀花木樨草苷高、中、低組則分別給予0.5%羧甲基纖維素鈉配制的金銀花木樨草苷懸浮液(100、50、25 mg/kg),連續(xù)4 周。末次給藥后進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,評(píng)估完成后進(jìn)行各個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)。

    2.3 行為學(xué)評(píng)估 于實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)開始第28 天灌胃給藥后1 h,進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn),評(píng)估各組大鼠行為狀態(tài)。

    2.3.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[9?10],將各組大鼠放入5×5 的25 格紙箱中(100 cm×100 cm),記錄5 min 內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況(直立次數(shù)、水平穿過格數(shù)),直立次數(shù)以雙前爪同時(shí)抬起為準(zhǔn),以3 只以上爪同時(shí)在1 個(gè)格子為穿越1 個(gè)水平格子。

    2.3.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9?10],用膠帶黏住大鼠尾端2 cm 的部位,懸掛在距離桌面50 cm 的架子上,頭朝下,前后左右均無攀抓物,一段時(shí)間后大鼠活動(dòng)減少,觀察6 min 的活動(dòng)情況,大鼠靜止垂直倒懸的時(shí)間為懸尾不動(dòng)時(shí)間,其中前1 min 不作記錄,記錄后5 mim 內(nèi)時(shí)間。

    2.3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[9?10],將大鼠置于一個(gè)透明容器內(nèi)(高度為60 cm,直徑為25 cm),保持水位為30 cm,水溫為(25±2)℃。觀察大鼠6 min 的行為狀況,記錄后5 min 內(nèi)游泳不動(dòng)時(shí)間(大鼠在水上漂浮沒有四肢的掙扎,偶爾移動(dòng)僅是保持頭部露在水面以上)。

    2.4 高效液相?熒光法(HPLC?F)測(cè)定大鼠海馬單胺遞質(zhì)水平 于實(shí)驗(yàn)第28 天完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后,斷頭處死各組大鼠,迅速在冰上剝離大腦,取出海馬組織,稱量后置組織冷凍管中,液氮快速冷凍備用。稱取一定量的海馬組織,加入適量預(yù)冷的0.1 mol/L 過氯酸(含0.3 mmol/L EDTA二鈉和0.5 mmol/L 亞硫酸鈉),冰水浴中超聲勻漿,4 ℃避光靜置一段時(shí)間后10 000 r/mim 離心10 min,取上清液過濾后,HPLC?F 測(cè)定單胺遞質(zhì)水平,取20 μL 過濾液自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定。條件為Diammonsilim C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相100 mmol/L 枸櫞酸?檸檬酸鈉緩沖液(pH =4.0),0.1 mmol/L EDTA,16% 甲醇;體積流量0.8 mL/min;熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)254 nm,發(fā)射波長(zhǎng)340 nm,單胺遞質(zhì)水平單位以ng/g 表示。

    2.5 RT?PCR 檢測(cè) 稱取各組大鼠海馬50 mg,采用TRIzol法提取總RNA,然后將1 μg 總RNA 通過cDNA Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR 在LightCycler@480(Roche 公司)設(shè)備中進(jìn)行,每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù),并以GAPDH作為內(nèi)參,定量PCR 特異產(chǎn)物通過溶解曲線分析,以2-ΔΔct表示相對(duì)基因表達(dá)變化,引物序列見表1。

    表1 引物序列

    2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),計(jì)量數(shù)據(jù)以()表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1 金銀花木樨草苷含有量測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)方法提取分離金銀花木樨草苷,并采用HPLC 進(jìn)行含有量測(cè)定[7?8],根據(jù)對(duì)照品質(zhì)量濃度(X,mg/mL)和峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸,得方程為Y=323.86X-61.62(r=0.999)。由圖1A 可知,木樨草苷色譜峰保留時(shí)間為25 min,1 g/mL 金銀花醇提物經(jīng)大孔樹脂分離后,其質(zhì)量濃度為4.74 mg/mL。

    圖1 各成分HPLC 色譜圖

    3.2 金銀花木樨草苷對(duì)抑郁大鼠行為學(xué)的影響 如表2 所示,實(shí)驗(yàn)前各組大鼠水平和垂直自主活動(dòng)量相近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);4 周后,模型組大鼠水平穿越格數(shù)和直立次數(shù)較空白組降低(P<0.05);給予氟西汀和金銀花木樨草苷干預(yù)后,大鼠水平穿格數(shù)和直立次數(shù)與模型組比較增加(P<0.05),且金銀花木樨草苷對(duì)抑郁大鼠自主活動(dòng)的改善作用隨著給藥劑量升高而增加,其療效接近陽性藥氟西汀。

    表2 各組大鼠水平方向運(yùn)動(dòng)格數(shù)和直立次數(shù)(, n=8)

    表2 各組大鼠水平方向運(yùn)動(dòng)格數(shù)和直立次數(shù)(, n=8)

    注:與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

    由表3 可知,實(shí)驗(yàn)前各組大鼠懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間非常接近,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);經(jīng)過4 周慢性應(yīng)激刺激造模后,模型組大鼠懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05);給予氟西汀和金銀花木樨草苷后,懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間減少(P<0.05),不動(dòng)時(shí)間縮短了30~50 s,大鼠抑郁不動(dòng)狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn),且高劑量組效果更優(yōu),呈現(xiàn)劑量依賴性。

    3.3 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)單胺遞質(zhì)水平的影響 圖2A 為神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5?HT 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖,峰保留時(shí)間分別為4.85、5.35、7.25 min,分離度良好??瞻捉M海馬組織色譜圖如圖2B 所示,分別在5.0、5.5、7.5 min檢測(cè)到NE、DA、5?HT。各組大鼠海馬組織神經(jīng)遞質(zhì)含有量測(cè)定結(jié)果見圖2C,與空白組比較模型組大鼠海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水平降低(P<0.05);藥物干預(yù)后,各組大鼠海馬組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平與模型組相比有大幅回升(P<0.05),其中氟西汀組更明顯,金銀花木樨草苷高劑量組次之,療效與給藥劑量有關(guān)。

    3.4 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)BDNF 蛋白和mRNA 表達(dá)的影響 如圖3 所示,與空白組相比,模型組海馬區(qū)BDNF 蛋白和mRNA 表達(dá)下調(diào)(P<0.05);氟西汀和金銀花木樨草苷能改善大鼠抑郁行為,還能使海馬區(qū)BDNF 蛋白、mRNA 表達(dá)上調(diào),與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    4 討論

    近年來,中醫(yī)藥發(fā)展迅速,從天然產(chǎn)物中提取有效活性單體治療相關(guān)疾病成為中醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文探究了金銀花木犀草苷對(duì)抑郁大鼠行為狀態(tài)的影響,結(jié)果證實(shí)了其良好的抗抑郁作用。大鼠經(jīng)過4 周慢性不可預(yù)知性應(yīng)激后,自主活動(dòng)量較空白組明顯減少,懸尾及游泳不動(dòng)時(shí)間顯著增加。這一結(jié)果和鄧海峰等人的研究一致[10],在不良應(yīng)激源刺激下,大鼠自主活動(dòng)減少,興趣喪失,長(zhǎng)期處于呆滯狀態(tài),絕望無助的表現(xiàn)與臨床抑郁癥患者精神運(yùn)動(dòng)性抑制、興趣缺失等癥狀相同。給予金銀花木樨草苷和氟西汀治療后,大鼠在曠場(chǎng)試驗(yàn)中自主活動(dòng)明顯增加,懸尾及游泳不動(dòng)時(shí)間縮短,證明了金銀花木樨草苷能改善動(dòng)物的抑郁行為,具有一定的抗抑郁作用。

    表3 各組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間和游泳不動(dòng)時(shí)間(, n=8)

    表3 各組大鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間和游泳不動(dòng)時(shí)間(, n=8)

    注:與空白組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。

    圖2 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)單胺遞質(zhì)水平的影響

    圖3 金銀花木犀草苷對(duì)大鼠海馬區(qū)BDNF 表達(dá)的影響

    抑郁癥的發(fā)病機(jī)制假說眾多,其中單胺遞質(zhì)假說和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說得到廣泛認(rèn)可。單胺遞質(zhì)假說提出抑郁癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5?HT、NE、DA 的缺乏。大腦5?HT 系統(tǒng)、NE 系統(tǒng)和DA 系統(tǒng)參與了睡眠和情緒等生理活動(dòng)的調(diào)控過程,而神經(jīng)遞質(zhì)的改變將直接或間接影響相關(guān)受體功能,5?HT 等水平低下的人群易產(chǎn)生抑郁情緒或行為[11]。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠海馬組織中的神經(jīng)遞質(zhì)5?HT、NE、DA 水平顯著下調(diào),這和王含彥等人的報(bào)道相符[12],在慢性應(yīng)激刺激下,大鼠中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)水平減少,相關(guān)受體功能紊亂,進(jìn)而產(chǎn)生抑郁樣行為。海馬區(qū)是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞,對(duì)情緒、學(xué)習(xí)和記憶的調(diào)控有著重要生理作用,臨床報(bào)道顯示抑郁癥患者海馬部位的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生了明顯改變[13]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)假說認(rèn)為[14?16],海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變是由于海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,BDNF 具有神經(jīng)保護(hù)和抗凋亡作用,其水平升高有助于抑制海馬神經(jīng)元的凋亡。研究表明[17?18],單胺遞質(zhì)系統(tǒng)與BDNF 的表達(dá)密切相關(guān),5?HT 等遞質(zhì)可以調(diào)節(jié)其表達(dá),反之BDNF 也可以保護(hù)5?HT 等神經(jīng)元,促進(jìn)突觸生長(zhǎng),增加突觸間隙神經(jīng)遞質(zhì)的含量。和空白組比較,模型組大鼠海馬區(qū)DBNF 蛋白和mRNA 表達(dá)顯著降低。金銀花木犀草苷可逆轉(zhuǎn)應(yīng)激刺激導(dǎo)致的海馬單胺遞質(zhì)水平的下降,給藥組大鼠海馬區(qū)5?HT、NE 和DA 水平顯著升高,同時(shí)BDNF 蛋白及mRNA 表達(dá)也明顯增加,說明金銀花木犀草苷可能是通過上調(diào)海馬區(qū)BDNF 表達(dá)量,逆轉(zhuǎn)海馬結(jié)構(gòu)和功能的改變,減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,從而調(diào)節(jié)中樞系統(tǒng)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)揮抗抑郁療效,且高劑量組抗抑郁效果優(yōu)于低劑量組。

    綜上所述,金銀花木樨草苷可逆轉(zhuǎn)并改善慢性應(yīng)激引起的抑郁樣行為,其可能的機(jī)制是上調(diào)海馬BDNF 表達(dá),增加中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平。

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