6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 腎小管上皮細胞損傷的保護作用

邵珠瑩 潘金火 張月嬋 蔣志濤 王 雪 馮星月 王建春?

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 南京210023； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬張家港醫(yī)院， 江蘇省企業(yè)研究生工作站， 江蘇 張家港215600）

關(guān)木通含馬兜鈴酸，20 世紀90 年代，國內(nèi)外一些學(xué)者報道顯示，應(yīng)用關(guān)木通可導(dǎo)致以進展性腎小管間質(zhì)損傷為主的腎毒性，國家藥監(jiān)局于2003 年取消了關(guān)木通的藥用標(biāo)準(zhǔn)［1?3］。但馬兜鈴酸A 作為馬兜鈴屬和細辛屬植物中所共有的成分，在很多常用的中藥中都含有，馬兜鈴、青木香、天仙藤、細辛、尋骨風(fēng)、朱砂蓮、廣防己等［4］，這些中藥臨床應(yīng)用廣泛，所以一味地禁用或者全面否定并不是解決這些藥物臨床應(yīng)用的最佳方法。在古代醫(yī)藥文獻中藥物毒性常是指這種藥物的偏性，在中醫(yī)理論看來，作為藥物都有毒性，關(guān)鍵是要正確使用。筆者的前期研究報道顯示［5］，UPLC?TQD?MS 法基于“辛開苦降” 理論探討關(guān)木通配伍干姜的減毒存效機制，前期的結(jié)果顯示干姜?關(guān)木通（2 ∶1）配伍煎煮后，關(guān)木通中的馬兜鈴酸A 降低率達87.79%，而配伍后的方劑對大鼠的利尿作用沒有影響，且對大鼠急性腎功能損傷明顯低于關(guān)木通生品。

干姜作為常用的藥食同源中藥材，據(jù) 《本草綱目》《本草經(jīng)疏》 等記載，其性熱，有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲等功效［6］。6?姜酚是干姜中的主要有效成分，研究發(fā)現(xiàn)其有抗炎、抗腫瘤、抗氧化以及降壓等作用［7］。為了驗證藥物配伍后對關(guān)木通的腎臟減毒作用，為含馬兜鈴酸A 的中藥飲片現(xiàn)有臨床應(yīng)用問題提供一定的指導(dǎo)，本實驗在體外觀察比較了馬兜鈴酸A 和6?姜酚＋馬兜鈴酸A 對正常人腎小管上皮細胞HK?2 的影響。

1 材料

1.1 細胞 人正常腎小管上皮細胞（HK?2 細胞，批號20180322），購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 試劑與藥物 馬兜鈴酸A（批號PRF8010623）、6?姜酚（批號PRF8012005）購自上海源葉生物科技有限公司（純度＞98%）；DMEM 培養(yǎng)基（以色列Biological Industries公司，批號171115?374）；胎牛血清（以色列Biological In?dustries 公司，批號Nu12955）；0.25% 胰蛋白酶（以色列Biological Industries 公司，批號J340823）；雙抗混合液（青霉素、鏈霉素，以色列Biological Industries 公司，批號170218?385）；熒光素二乙酸酯（阿拉丁試劑有限公司，批號201804）；SOD 試劑盒、MDA 試劑盒、GSH 試劑盒、GSH?Px 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20180234、20180626、20180321、20180422 ）；GAPDH Rabbit IgG（美國Santa Cruz 公司，批號A6765）；Rabbit polyclonal to NF?kB p65（英 國 Abcam 公 司，批 號GR568343?1）；Rabbit polyclonal to p?NF?kB p65（英 國Abcam 公 司，批 號 GR530813?2 ）；Caspase?3 Rabbit polyclonal IgG（美 國 Bioworld 公 司，批 號 CJ54654）；Cleaved?Caspase?3 Rabbit polyclonal IgG（美 國Bioworld 公司，批號JJ761202）。其他試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 MicroCL 17R 高速低溫離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；ELx800 酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器公司）；DMI3000B 倒置光學(xué)顯微 鏡（德國徠卡公司）；Master?D UVF 超純水機（上海和泰儀器有限公司）；SK?O180?E 圓形搖床（大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；EPS300 電泳電源、VE?180 垂直電泳槽、5300 凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；FS?500 封口儀（德清拜杰電氣有限公司）。

2 方法

2.1 HK?2 細胞的培養(yǎng) 細胞置含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按生長狀況用胰酶消化后，換液傳代培養(yǎng)，取4～6 代用于后續(xù)實驗。

2.2 馬兜鈴酸A 處理HK?2 細胞 精密稱取馬兜鈴酸A 對照品適量，DMEM 培養(yǎng)液溶解稀釋，得到40、20、10、5、1 μg／mL 對照品溶液，使用前用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

將HK?2 細胞以5×105／mL 濃度接種于96 孔板中，每孔100 μL。實驗分組為0（正常組）、1、5、10、20、40 μg／mL馬兜鈴酸A 組，每組10 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，各孔加入CCK?8 試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，在450 nm 波長下用酶標(biāo)儀測定光密度（OD），計算細胞存活率，空白孔每孔加入200 μL DMEM 培養(yǎng)液，細胞存活率＝［（OD藥物組-OD空白孔）／（OD正常組?OD空白孔）］×100%。

2.3 6?姜酚處理損傷的HK?2 細胞 精密稱取6?姜酚對照品適量，用DMEM 培養(yǎng)液溶解并進行稀釋，得到300、200、100、50 μg／mL 對照品溶液，使用前用0.22 μm 微孔濾膜過濾。

4～6 代HK?2 細胞用細胞計數(shù)板計數(shù)后，以DMEM 培養(yǎng)液稀釋細胞，細胞濃度約為5×105／mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，24 h 細胞孵育貼壁后，棄去原培養(yǎng)液。將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（50、100、200、300 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）共處理組，每組10 個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μL CCK?8 試劑，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在450 nm 波長下用酶標(biāo)儀測定光密度（OD），確定6?姜酚最佳濃度。

2.4 FDA 活細胞熒光染色觀察細胞形態(tài) 將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，將細胞孵育完畢后，用移液槍棄去孔中的培養(yǎng)基。5 mg FDA 溶解于1 mL 丙酮，作為FDA／丙酮母液（5 mg／mL），PBS（1 ∶ 1 000）稀釋 成10 μg／mL FDA／PBS 溶液，各孔加入200 μL 孵育10 min，棄去孔中液體，再加入PBS 緩沖液200 μL，5 min 后棄液，再加入PBS 緩沖液200 μL，倒置熒光顯微鏡于488 nm 波長處激發(fā)熒光并拍照。

2.5 Hoechst 熒光染色觀察細胞凋亡 將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，將細胞孵育完畢后，用移液器棄去孔中的培養(yǎng)基，各孔加入細胞固定液200 μL，固定10 min后棄固定液，各孔以200 μL PBS 緩沖液清洗3 次，棄所有液體，加入200 μL Hoechst 染色液，5 min 后棄染色液，各孔以200 μL PBS 緩沖液清洗3 次，最后1 次清洗后不丟棄上清液，倒置熒光顯微鏡于350 nm 波長處激發(fā)熒光并拍照。

2.6 吸光度法檢測細胞上清SOD、MDA、GSH 和GSH?Px水平 將細胞分為正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，孵育完畢后收集各孔上清液，按照SOD、MDA、GSH 和GSH?Px檢測試劑盒的說明書，分光光度計測定吸光度，計算各組酶活性。

2.7 Western blot 檢測蛋白表達 4～6 代HK?2 細胞計數(shù)后，DMEM 培養(yǎng)液稀釋至細胞濃度約為1×106／mL，接種于6 孔板，每孔1 mL，12 h 細胞孵育貼壁后棄液。設(shè)正常組、馬兜鈴酸A 組（10 μg／mL）、6?姜酚（200 μg／mL）＋馬兜鈴酸A（10 μg／mL）組，每組設(shè)置6 個復(fù)孔，共3 組，各組加入含有對應(yīng)藥物的培養(yǎng)基2 mL，對照組加入DMEM 單培2 mL，培養(yǎng)48 h，細胞刮剝離細胞，收集至EP 管，裂解細胞并離心收集上清后，Bradford 法進行蛋白定量，蛋白變性后取等量總蛋白進行SDS?PAGE 電泳，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，封閉液封閉2 h，分離PVDF 膜，分開孵育GAPDH（1 ∶4 000）和NF?κB p65（1 ∶1 000）、p?NF?κB p65（1 ∶1 000）、caspase?3（1 ∶1 000）、cleaved?caspase?3（1 ∶1 000）抗體，4 ℃過夜后清膜3 次，兔二抗（1 ∶10 000）孵育2 h 后清洗膜3 次，凝膠成像體統(tǒng)化學(xué)發(fā)光成像。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 熒光圖片數(shù)據(jù)應(yīng)用Image pro plus 軟件計數(shù)，Western blot 數(shù)據(jù)應(yīng)用Quatity one 軟件統(tǒng)計灰度值，計量數(shù)據(jù)用（）表示，結(jié)果用Graph Pad Prism 5.0 軟件進行方差分析和作圖，多組間的比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 馬兜鈴酸A 對HK?2 細胞活性影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A（5～40 μg／mL）降低HK?2 細胞存活率（P＜0.01），且呈濃度依賴性（表1）；5 μg／mL 馬兜鈴酸A 組細胞存活率接近75%，20、40 μg／mL 馬兜鈴酸A 組細胞損傷太強，死亡太多，故選定10 μg／mL 馬兜鈴酸A 來刺激細胞。

表1 不同質(zhì)量濃度馬兜鈴酸A 對HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

表1 不同質(zhì)量濃度馬兜鈴酸A 對HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01。

3.2 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 細胞存活率的影響 與正常組對比，10 μg／mL 馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞存活率降低（P＜0.01）；不同濃度6?姜酚處理后，HK?2 細胞凋存活率有不同程度的升高，在200 μg／mL 時最高，達到72%左右，故選取200 μg／mL。見表2。

表2 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

表2 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 細胞存活率的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01。

3.3 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 細胞形態(tài)的影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞數(shù)目減少；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞數(shù)目增加。正常組細胞形態(tài)清晰，細胞體積飽滿，細胞之間聯(lián)系緊密；給藥組細胞稍固縮，細胞間分散；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞間分散度較小，飽滿細胞的數(shù)目較多。見圖1。

圖1 各組HK?2 細胞形態(tài)（×100）

3.4 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 細胞凋亡的影響 正常組HK?2 細胞幾乎無凋亡，細胞核無分裂固縮形態(tài)；與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞凋亡率升高（P＜0.01）；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞凋亡率降低（P＜0.01）。見表3、圖2。

表3 各組HK?2 細胞凋亡率（， n＝10）

表3 各組HK?2 細胞凋亡率（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與馬兜鈴酸A 組比較，＃＃P＜0.01。

圖2 各組HK?2 細胞凋亡（×100）

3.5 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 細胞上清液中酶的影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞上清液中MDA、GSH?Px 水平升高（P＜0.01），SOD、GSH 水平降低（P＜0.01）；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞上清液中MDA、GSH?Px 水平降低（P＜0.01），SOD、GSH 水平升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組HK?2 細胞上清液中酶水平（， n＝10）

表4 各組HK?2 細胞上清液中酶水平（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與馬兜鈴酸A 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 6?姜酚對馬兜鈴酸A 誘導(dǎo)的HK?2 細胞蛋白表達的影響 與正常組相比，馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞中p?NF?κB p65、cleaved?capase?3 蛋白表達升高（P＜0.01）；與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組HK?2 細胞中p?NF?κB p65、Cleaved?Capase?3 蛋白表達降低（P＜0.01）。見圖3。

圖3 各組HK?2 細胞中蛋白表達（×100）

4 討論

關(guān)木通曾在臨床被廣泛應(yīng)用，在大量研究人員報道了其腎毒性后被限制使用。課題組早年對關(guān)木通進行了系統(tǒng)的綜述［8］，詳細總結(jié)了關(guān)木通的化學(xué)成分、藥理學(xué)研究、臨床應(yīng)用及毒理學(xué)研究。既往研究也顯示，關(guān)木通的不同炮制品中的馬兜鈴酸A 的含有量差異顯著，且馬兜鈴酸A的水平與炮制品對大鼠腎臟功能的損傷有相關(guān)性［9?10］。

吳建紅等［11］研究了導(dǎo)赤散配伍關(guān)木通對人腎小管上皮細胞周期的影響。陳燕玲等［12］通過6?姜酚保護由丙酮醛損傷的HK?2 細胞，發(fā)現(xiàn)6?姜酚具有保護HK?2 細胞減輕受損傷程度的作用。本研究結(jié)果顯示，與馬兜鈴酸A 組相比，6?姜酚＋馬兜鈴酸A 組夠顯著升高HK?2 細胞的活性，改善細胞的形態(tài)，減少細胞凋亡的數(shù)目，降低細胞上清液中MDA 和GSH?Px 的水平，并增強上清液中SOD 和GSH 水平，降低HK?2 細胞內(nèi)p?NF?κB p65 和Cleaved?Capase?3 蛋白表達，表明6?姜酚可能通過提高HK?2 細胞的抗氧化應(yīng)激能力及抑制NF?κB 介導(dǎo)的炎癥通路對抗馬兜鈴酸A 引起的HK?2 細胞損傷。由此表明，在使用含馬兜鈴酸的中藥時，可給予干姜或其有效成分以降低患病風(fēng)險，從而為關(guān)木通臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。