光皮木瓜化學成分研究及其神經保護活性

李 孟 張志廣 王夢夢石靜亞張靖柯呂錦錦常 遠鄭曉珂馮衛(wèi)生?

（1.河南中醫(yī)藥大學， 河南 鄭州450046； 2.河南省中藥開發(fā)工程技術研究中心， 河南 鄭州450046；3.中央民族大學藥學院， 北京100081）

光皮木瓜Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne為薔薇科木瓜屬植物木瓜的成熟果實，又名榠楂、土木瓜。其果實形狀為長橢圓形或橢圓形，外皮光滑，果肉味酸、澀，性平，歸胃、肝、肺經，具有利胃舒筋、祛風濕、消痰止咳的功效［1?3］，廣泛分布于陜西、山東、河南、湖北、安徽等省。木瓜果實營養(yǎng)豐富，被譽為“百益果王”，是集加工食用、藥用和觀賞于一體的、極具開發(fā)價值的新型經濟樹種之一［4］。河南南陽地區(qū)種植有大面積的光皮木瓜，但對其化學成分研究較少，課題組前期從中分離得到3 個生物堿類化合物［5］，本實驗采用多種色譜技術又分得9 個萜類化合物，均為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)，并采用MTT 法檢測各化合物對皮質酮誘導的大鼠嗜鉻細胞瘤細胞（PC?12 細胞）損傷的保護作用，結果表明，化合物3～5、7 對PC?12細胞具有顯著活性。

1 材料

Bruker AVANCE Ⅲ500 核磁共振儀（TMS 為內標）、Bruker maxis HD 型飛行時間質譜儀（德國Bruker 公司）；Nicolet iS 10 Microscope Spectrometer紅外光譜儀（美國Thermo fisher 公司）；Shimadzu UV?2401PC apparatus 紫外光譜儀（日本島津公司）；Chirascan qCD（英國應用光物理公司）；LC50 型高壓制備液相色譜儀［賽譜銳思（北京）科技有限公司］；iMark 酶標儀（美國Bio?Rad 公司）；ECLIPSE TS100 倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；SW?CJ?2FD 超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；Forma 3111 細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher 公司）；Centrifuge?5804R 小型高速低溫冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；微量加樣器（法國Gilson 公司）；多功能暗箱紫外透色儀（ZF?90）、優(yōu)普超純水機、紅外光譜儀、冷凍干燥機（EYELA PDU?2110）、鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；A?1000S 水流抽氣機（東京理化器械株式會社）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）。柱層析填充劑所用Diaion HP?20、MCI Gel CHP?20、Toyopearl HW?40（日本三菱化學公司）；Sephadex LH?20（瑞士Parmacia Biotech 公司）；柱層析所用硅膠H（160～200 目，青島海洋化工廠）。所用分析純和色譜純試劑（北京化工廠和天津第三化學試劑廠）；DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco 公司）；青霉素、硫酸鏈霉素（華北制藥股份有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；MTT、DMSO、hepes（美國Amresco 公司）。

光皮木瓜采自河南省方城縣，經河南中醫(yī)藥大學藥學院陳隨清教授及董誠明教授鑒定為薔薇科木瓜屬植物光皮木瓜Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne 的成熟果實。

2 提取與分離

取鮮品30 kg，去籽切成1.5 cm3，用50%丙酮組織破碎提取。提取液減壓濃縮、冷凍干燥，得50%丙酮提取總浸膏（2.67 kg），80% 乙醇醇沉、濾過，上清液離心液減壓濃縮至無醇味的浸膏狀，上Diaion HP?20 大孔吸附樹脂柱，乙醇?水（0 ∶100、10 ∶90、20 ∶80、30 ∶70、40 ∶60、50 ∶50、70 ∶30、95 ∶5）梯度洗脫，合并各部位得到8 個餾分（Fr.1～8）。Fr.3（39.3 g）經Toyopearl HW?40C 柱色譜，甲醇?水（0 ∶100、10 ∶90、20 ∶80）梯度洗脫，合并相同餾分，得到Fr.3.1～3.5，F(xiàn)r.3.1 經Sephadex LH?20 和半制備液相，得到化合物2（10.8 mg）、3（5.4 mg）、4（7.6 mg）、5（11.2 mg）；Fr.3.4 經ODS、Sephadex LH?20 柱色譜和半制備液相，得到化合物6（4.3 mg）、7（6.1 mg）。Fr.3.2 經ODS?18 反相色譜柱，甲醇?水（10 ∶90、20 ∶80、30 ∶70、40 ∶60）梯度洗脫，合并相同餾分，再經Sephadex LH?20 柱色譜和半制備液相，得到化合物1（3.2 mg）、8（4.3 mg）、9（4.8 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：淡黃色固體（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI?MSm／z：441.2 ［M ＋ Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.31（1H，dd，J＝0.7，11.5 Hz，H?3），6.48（1H，dd，J＝11.5，15.0 Hz，H?4），6.17（1H，ddd，J＝7.3，7.9，15.0 Hz，H?5），5.53（1H，d，J＝ 8.0 Hz，H?1′），3.68（3H，s，H?13），2.57（1H，dd，J＝3.4，15.1 Hz，H?9b），2.40（1H，m，H?6b），2.35（1H，dd，J＝9.5，15.1 Hz，H?9a），2.09（1H，m，H?6a），1.93（3H，s，H?11），0.90（3H，s，H?12）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：174.4（C?10），168.7（C?1），143.9（C?2），141.4（C?3），128.7（C?4），125.4（C?2），95.9（C?1′），78.8（C?5′），78.1（C?3′），74.0（C?2′），72.9（C?8），71.1（C?4′），62.3（C?6′），52.1（C?13），15.8（C?12），12.5（C?11）。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］基本一致，故鑒定為8?hydroxy?2，7?dime?thyl?2E，4E?decadienedioic acid 1?β?D?glucopyranyl ester 10?methyl ester。

化合物2：黃色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI?MSm／z：279.1 ［M ＋ Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.17（1H，d，J＝10.8 Hz，H?3），6.45（1H，dd，J＝10.8，15.0 Hz，H?4），6.08（1H，dt，J＝15.0，7.8 Hz，H?5），3.86（1H，m，H?8），3.66（3H，s，?OCH3），2.50（1H，dd，J＝4.2，15.0 Hz，H?9a），2.44（1H，m，H?6a），2.33（1H，dd，J＝9.0，15.0 Hz，H?9b），2.09（1H，dt，J＝13.8，7.8 Hz，H?6b），1.89（3H，s，H?11），1.69（1H，m，H?7），0.92（3H，d，J＝6.6 Hz，H?12）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：174.4（C?10），172.1（C?1），142.5（C?5），140.1（C?3），128.8（C?4），126.3（C?2），72.9（C?8），52.1（?OCH3），40.3（C?9），40.0（C?7），37.1（C?6），12.8（C?12），12.6（C?11）。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］基本一致，故鑒定為monomethyl glansreginate。

化合物3：淡黃色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI?MSm／z：427.2 ［M ＋ Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.18（1H，d，J＝11.3 Hz，H?3），6.47（1H，dd，J＝11.3，15.0 Hz，H?4），6.09（1H，dt，J＝15.0，7.8 Hz，H?5），4.33（1H，d，J＝ 7.8 Hz，H?1′），4.02（1H，m，H?8），3.96（1H，m，H?6′a），3.82（1H，m，H?6′b），3.36～3.45（4H，m，H?2′，H?3′，H?4′，H?5′），2.64（1H，m，H?9），2.47（1H，m，H?6），1.96（1H，m，H?7），1.89（3H，s，H?12），0.95（3H，s，H?11）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：176.3（C?10），172.1（C?1），142.6（C?5），140.2（C?3），128.9（C?4），126.3（C?2），104.7（C?1′），81.8（C?8），78.1（C?5′），77.7（C?3′），75.3（C?2′），71.5（C?4′），62.7（C?6′），39.0（C?9），38.6（C?7），36.9（C?6），15.5（C?12），12.7（C?11）。以上數(shù)據(jù)與文獻 ［8］基本一致，故鑒定為2，7?dimethyl?2，4?diene?deca?α，ω?diacid。

化合物4：棕色粉末（甲醇），ESI?MSm／z：207.1 ［M＋Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：6.76（1H，dd，J＝7.6，6.5 Hz，H?3），5.91（1H，dd，J＝17.4，10.8 Hz，H?7），5.22（1H，dd，J＝17.4，1.5 Hz，H?8a），5.05（1H，dd，J＝17.4，1.5 Hz，H?8b），2.23（2H，m，H?4），1.79（3H，s，H?10），1.59（2H，m，H?5），1.27（3H，s，H?9）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：170.5（C?1），145.9（C?7），143.9（C?3），128.8（C?2），112.4（C?8），73.6（C?6），41.8（C?5），24.5（C?4），27.8（C?9），12.3（C?10）。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］基本一致，故鑒定為（6S）?menthiafolic acid。

化合物5：黃色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI?MSm／z：207.1 ［M ＋ Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.18（d，J＝11.4 Hz，H?6），6.47（1H，dd，J＝11.4，15.0 Hz，H?5），6.09（1H，dt，J＝15.0，7.5 Hz，H?4），3.40（2H，m，H?8），2.35（2H，m，H?2），2.03（1H，m，H?3a），1.89（3H，s，H?10），1.72（1H，m，H?3b），0.91（3H，s，H?9）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：172.1（C?1），142.4（C?5），140.1（C?6），128.7（C?4），126.3（C?7），67.7（C?8），38.0（C?3），37.1（C?2），16.8（C?10），12.6（C?9）。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］基本一 致，故鑒定 為（4E，6E）?2，7?dimethyl?8?hydroxyoctadienoic acid。

化合物6：黃色粉末（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI?MSm／z：265.1 ［M ＋ Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.17（1H，d，J＝10.8 Hz，H?3），6.45（1H，dd，J＝10.8，15.0 Hz，H?4），6.08（1H，dt，J＝15.0，7.8 Hz，H?5），3.86（1H，m，H?8），2.50（1H，dd，J＝4.2，15.0 Hz，H?9a），2.44（1H，m，H?6a），2.33（1H，dd，J＝9.0，15.0 Hz，H?9b），2.09（1H，dt，J＝13.8，7.8 Hz，H?6b），1.89（3H，s，H?11），1.69（1H，m，H?7），0.92（3H，d，J＝6.6 Hz，H?12）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：174.4（C?10），172.1（C?1），142.5（C?5），140.1（C?3），128.8（C?4），126.3（C?2），72.9（C?8），40.3（C?9），40.0（C?7），37.1（C?6），12.8（C?12），12.6（C?11）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］基本一致，故鑒定為glansreginic acid。

化合物7：黃色油狀物（甲醇），易溶于甲醇、水。ESI?MSm／z：221.1 ［M ＋ Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：7.14（1H，d，J＝11.3 Hz，H?3），6.46（1H，t，J＝14.7 Hz，H?4），6.05（1H，m，H?5），2.55（1H，m，H?7），2.50（1H，m，H?6a），2.31（1H，m，H?6b），1.89（3H，s，H?9），1.60（3H，s，H?10）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：179.6（C?1），172.0（C?8），140.6（C?5），139.7（C?3），129.1（C?4），127.1（C?2），40.5（C?7），38.1（C?6），17.2（C?9），12.6（C?10）。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］基本一致，故鑒定為2，7?dimethyl?2E，4E?octadienedioic acid。

化合物8：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇、乙 醇。ESI?MSm／z：395.2 ［M ＋Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.35（1H，d，J＝7.8 Hz，H?1′），3.95（1H，dd，J＝11.7，5.4 Hz，H?6a′），3.85（1H，m，H?9），3.65（1H，dd，J＝11.7，5.4 Hz，H?6b′），2.52（1H，m，H?7a），2.45（2H，t，J＝6.7 Hz，H?3），2.29（1H，m，H?7b），1.80（2H，t，J＝6.7 Hz，H?2），1.74（3H，s，H?11），1.64（2H，m，H?8），1.21（3H，d，J＝6.2 Hz，H?10），1.18（6H，s，H?12，13）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：201.6（C?4），168.8（C?6），141.6（C?5），102.3（C?1′），78.2（C?5′），77.9（C?3′），75.7（C?9），75.2（C?2′），71.8（C?4′），62.9（C?6′），38.4（C?8），37.3（C?2），35.1（C?3），27.9（C?7），27.2（C?12），27.1（C?13），19.8（C?10），11.7（C?11）。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］基本一致，故鑒定為9ξ?O?β?D?glucopyr?anosyloxy?5?megastigmen?4?one。

化合物9：白色粉末（甲醇），易溶于甲醇、乙 醇。ESI?MSm／z：395.2 ［M ＋Na］＋。1H?NMR（CD3OD，500 MHz）δ：4.32（1H，d，J＝7.8 Hz，H?1′），3.85（1H，dd，J＝11.8，2.3 Hz，H?2），3.66（1H，dd，J＝10.6，5.1 Hz，H?6a′），3.57（1H，dd，J＝10.6，5.1 Hz，H?6b′），2.52（2H，m，H?8），2.25（2H，m，H?7），2.12（3H，s，H?10），1.99（1H，m，H?4a），1.91（1H，m，H?3a），1.82（1H，m，H?4b），1.66（1H，m，H?3b），1.60（3H，s，H?11），1.08（3H，s，H?12），0.99（3H，s，H?13）；13C?NMR（CD3OD，125 MHz）δ：211.7（C?9），136.5（C?6），128.2（C?5），101.8（C?1′），82.8（C?2），78.3（C?3′），77.8（C?5′），75.1（C?2′），71.9（C?4′），63.0（C?6′），45.1（C?8），40.6（C?1），31.2（C?12），29.7（C?10），26.6（C?13），23.8（C?3），23.4（C?4），22.6（C?7），19.6（C?12）。以上數(shù)據(jù)與文獻［13］基本一致，故鑒定為icariside B9。

4 對皮質酮誘導的PC?12 細胞損傷的保護作用

4.1 細胞培養(yǎng) 參考文獻［14］方法，PC?12 細胞加入含10% 胎牛血清的1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期者進行實驗。

4.2 MTT 法檢測細胞活性 取對數(shù)生長期的PC?12 細胞，以4×104／mL 濃度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板內，每孔200 μL，待細胞完全貼壁后分為正常組、模型組（CORT 造模）、化合物1～9 給藥組，棄去原培養(yǎng)基后加入相同濃度的含藥完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。36 h 后，每孔加入5 mg／mL MTT 溶液20 μL，37 ℃下培養(yǎng)4 h 后吸出培養(yǎng)液，每孔加入150 μLDMSO，振蕩10 min，酶標儀于490 nm 波長處測定吸光度（A），以正常細胞（未處理）吸光度所對應的細胞存活率為100%，計算各化合物細胞存活率，每組重復3 次，結果見表1。

表1 化合物1～9 對PC?12 細胞活性的影響（， n＝4）Tab.1 Effects of compounds 1-9 on the viability of PC?12 cells（， n＝4）

表1 化合物1～9 對PC?12 細胞活性的影響（， n＝4）Tab.1 Effects of compounds 1-9 on the viability of PC?12 cells（， n＝4）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

4.3 活性實驗 與模型組比較，在濃度為5 μmol／L時，化合物3～5、7 可顯著提高皮質酮誘導PC?12 細胞損傷的活力，表明它們可能具有潛在的神經保護活性。

5 討論

光皮木瓜的記載始于《本草經集注》，其果實味酸、澀，性平，具有和胃舒筋、祛風濕、消痰止渴的功效，具有抗腫瘤、保肝、免疫調節(jié)、抗菌、降血糖、抗老年癡呆、抗病毒、抗氧化等多種生物活性［15?18］。本研究從中分離鑒定了9 個萜類化合物，均為首次從該植物中獲得，并對其進行了PC?12 細胞損傷的保護作用研究，在一定程度上豐富了對光皮木瓜化學成分及生物活性的認識，可為其有效物質的篩選和分析提供依據(jù)。