金母顆粒提取工藝的優(yōu)化

李曉霞 王志萍 ? 蔣雅嫻蘇佳昇劉 笑王孝勛馮 橋

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)， 廣西 南寧530001； 2.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗室， 廣西 南寧530001； 3.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院， 廣西 南寧530001）

金母方是課題組前期優(yōu)化壯藥經(jīng)驗方——婦雅凈方而成，由金剛刺、火炭母、白背葉根等9 味特色壯藥材組成，具有清火毒、除濕毒、滅蟲毒、通龍路和水路等功效，臨床上主要用于治療陰道炎、慢性宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、附件炎。方中火炭母、虎杖、黃柏所含有效成分大多為醇溶性物質(zhì)［1］，對盆腔炎性疾病后遺癥的療效顯著，而且毒性較小，工藝簡便，質(zhì)量可控［2?4］。該方原劑 型為湯劑，現(xiàn)擬將其改為顆粒劑，選用何種溶劑及工藝進(jìn)行提取是決定該制劑臨床療效的關(guān)鍵。

目前，優(yōu)化中藥復(fù)方提取工藝已成為研究熱點(diǎn)，有學(xué)者以成分含有量或結(jié)合干浸膏提取率為評價指標(biāo)，正交實(shí)驗、星點(diǎn)設(shè)計或結(jié)合人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化提取工藝［5?7］；還有學(xué)者先以正交試驗優(yōu)化提取工藝，再通過藥效學(xué)實(shí)驗對其進(jìn)行驗證［8］。本實(shí)驗選擇抗炎、抑菌活性作為主要考核指標(biāo)，并結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計?效應(yīng)面法來優(yōu)化壯藥金母顆粒提取工藝。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；SQP 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；LDZX?75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；DFY?1000型搖擺式高速萬能打粉機(jī)（上海精勝科學(xué)儀器有限公司）；HWS?26 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；LPH?250?A 型生化培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；DHG?9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；98?1?B 型電子調(diào)溫電熱套。

1.2 試劑與藥物 金剛刺（批號Y18080604）、火炭母（批號17070202）、土茯苓（18031901）、白背葉根（批 號 Y18101502 ）、虎 杖（批 號18051501）、犁頭草（批號Y18080604）等藥材均購自廣西寶正藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典》 一部或《廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 各藥材項下要求。地塞米松（批號171702，廣東南國藥業(yè)有限公司）；營養(yǎng)瓊脂（批號1080331）、水解酪蛋白胨（MH）肉湯（批號1069061）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；紅四氮唑［批號I18007011，阿拉丁試劑（上海）有限公司］?；⒄溶眨?11575?01603，純度87.3%）、落新婦苷（111798?01504，純度93.9%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

1.3 動物 SPF 級雌性昆明種小鼠32 只，體質(zhì)量（20±2）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2016?0002。

1.4 細(xì)菌 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫實(shí)驗中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖苷、落新婦苷含有量測定

2.1.1 色譜條件 Inertsil ODS?3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?水（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長291 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以虎杖苷計，不低于3 000；以落新婦苷計，不低于5 000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取虎杖苷、落新婦苷對照品適量，稀乙醇制成每1 mL 分別含兩者32 μg、0.5 mg 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 將金母顆粒提取液定容至2 000 mL量瓶中，混勻后精密量取5 mL，4 000 r／min離心10 min，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 陰性樣品溶液制備 按處方工藝取缺虎杖、缺金剛刺、缺土茯苓的陰性樣品適量，加10 倍量60%乙醇提取2 次，每次1 h，300 目濾布過濾，濃縮后60%乙醇定容于2 000 mL 量瓶中，精密量取5 mL，4 000 r／min 離心10 min，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.5 線性范圍考察 取對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為虎杖苷Y＝8×106X＋8 163.1（R2＝0.999 9）、落新婦苷Y＝2×106X＋72 995（R2＝0.999 2），分別在0.010 9～0.314 3、0.117 6～3.380 4 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得虎杖苷、落新婦苷峰面積RSD 分別為2.88%、1.50%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取藥材6 份，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得虎杖苷、落新婦苷峰面積RSD 分別為0.99%、1.47%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，于2、4、6、8、12、24 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得虎杖苷、落新婦苷峰面積RSD分別為2.19%、2.96%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 精密量取虎杖苷、落新婦苷含有量已知的供試品溶液9 份，精密加入對照品溶液適量，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得虎杖苷、落新婦苷平均加樣回收率分別為99.46%、100.84%，RSD 均小于5%。

2.2 提取溶劑種類篩選

2.2.1 提取物制備 按處方比例稱取藥材共109 g，平行2 份，加入10 倍量水、60%乙醇加熱回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，精密量取2 mL，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算虎杖苷、落新婦苷含有量。將提取液濃縮至近干，取浸膏適量，滅菌純水制成1 000 mg 生藥／mL藥液，依次稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 mg 生藥／mL，供體外抑菌實(shí)驗用；另取浸膏適量，純水制成708.5 mg 飲片／mL 藥液，供棉球致小鼠肉芽腫實(shí)驗用。

2.2.2 棉球致小鼠肉芽腫實(shí)驗 參考文獻(xiàn)［9］報道。32 只小鼠腹腔注射 10% 水合氯醛（0.04 mL／10 g）麻醉后，將已高壓滅菌的5 mg 棉球植于腋下。24 h 后，將小鼠隨機(jī)分為模型組、陽性組（地塞米松）、金母顆粒水提物組、金母顆粒醇提物組，每組8 只，均以0.2 mL／10 g 劑量灌胃給予相應(yīng)藥物（模型組給予等量蒸餾水），連續(xù)7 d，于第8 天處死小鼠，打開原切口，將棉球連同周圍結(jié)締組織一起取出，剔除脂肪組織，置于60 ℃烘箱中干燥12 h，精密稱定質(zhì)量，將其減去原棉球質(zhì)量，即為肉芽腫質(zhì)量，再計算其抑制率，結(jié)果見表2。由此可知，與模型組比較，金母顆粒水提物組、金母顆粒醇提物組肉芽腫質(zhì)量降低（P＜0.01），以后者更明顯（P＜0.01）。

表2 金母顆粒對肉芽腫質(zhì)量、抑制率的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Jinmu Granules on the weight and inhib?itory rate of granuloma（， n＝8）

表2 金母顆粒對肉芽腫質(zhì)量、抑制率的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Jinmu Granules on the weight and inhib?itory rate of granuloma（， n＝8）

注：與模型組比較，??P ＜0.01；與金母顆粒水提物組比較，＃＃P＜0.01。

2.2.3 體外抑菌實(shí)驗 參考文獻(xiàn)［9］報道。將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌菌液在4 000 r／min下離心15 min，棄去溶液，沉淀加生理鹽水制成菌液濃度1×108CFU／mL 的混懸液。在96 孔板最外圍的一圈中加入200 μL 水，往B2～B11、C2～C11、D2～D11、F2～F11、G2～G11 孔里加入“2.2.1” 項下藥液、混懸液各100 μL，往E2～E4、E5～E7 孔里加入混懸液各200 μL，緩慢搖勻后置于生化培養(yǎng)箱中，在37 ℃下培養(yǎng)24 h。配制1%紅四氮唑溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），過0.22 μm 微孔濾膜，各取5 μL 加到每孔中，搖勻，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，觀察各孔顯色情況，未顯現(xiàn)粉紅色的最低濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果，金母顆粒水提物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC 均為62.50 mg／mL，而醇提 物對兩者的 MIC 均 為31.25 mg／mL，即其抑菌活性更強(qiáng)，與 “2.2.2”項下結(jié)果一致。

2.2.4 虎杖苷、落新婦苷含有量測定 取“2.2.1”項下水提液、醇提液各2 mL，過0.22 μm微孔濾膜，在“2.1.1” 項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算虎杖苷、落新婦苷含有量。結(jié)果，金母顆粒水提物中兩者分別為0.277 5、1.685 0 mg／g，而醇提物中分別為1.144 5、5.551 2 mg／g，即在后 者中更 高，與“2.2.2” 和“2.2.3” 項下結(jié)果一致。

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)篩選 按處方比例稱取藥材共109 g，平行5 份，分別加入10 倍量50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加熱回流提取2 次，每次1 h，300 目濾布過濾，合并濾液，真空濃縮回收溶劑至無醇味，轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，水浴至近干，提取液用滅菌純水制成1 000 mg 生藥／mL 藥液，依次稀釋至500、250、125、62.5、31.25、15.62、7.81、3.91、1.95 mg 生藥／mL，按“2.2.3” 項下方法進(jìn)行實(shí)驗，結(jié)果見表3。由此可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～90%范圍內(nèi)均能不同程度地抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌增殖，以60%時最強(qiáng)。

表3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌MIC 的影響（mg／mL）Tab.3 Effects of ethanol concentration on the MICs of Staphylococcus aureus and Escherichia coli（mg／mL）

2.4 星點(diǎn)設(shè)計?效應(yīng)面法 對金母顆粒有效成分進(jìn)行分析后，將虎杖苷、落新婦苷含有量權(quán)重系數(shù)均設(shè)定為0.4；干膏率為次要指標(biāo)，故將其權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.2，采用Hassan 法對各指標(biāo)進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換后計算“歸一值”（d），公式為di＝（Yi-Ymin）／（Ymax-Ymin），其中Ymax為指標(biāo)最大值，Ymin為指標(biāo)最小值，Yi為指標(biāo)i測定值，i為指標(biāo)數(shù)，再將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為總評“歸一值”（OD），公式為OD＝，其中d1為虎杖苷含有量 “歸一值”，d2為落新婦苷含有量“歸一值”，d3為干膏率“歸一值”。

選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時間（B）、乙醇用量（C）作為影響因素（提取次數(shù)為非連續(xù)變量，無法進(jìn)行回歸處理，故按前期單因素試驗結(jié)果將其固定為2 次），落新婦苷、虎杖苷含有量及干膏率作為評價指標(biāo)，設(shè)計3 因素5 水平試驗。因素水平見表4。

表4 因素水平Tab.4 Factors and levels

按處方比例稱取藥材共109 g，按表4 參數(shù)加熱回流提取2 次，300 目紗網(wǎng)過濾，收集濾液，測定提取液中虎杖苷、落新婦苷含有量及干膏率，計算OD值（Y），結(jié)果見表5。

對表5 數(shù)據(jù)分別進(jìn)行多元線性回歸、二項式擬合，方程Y＝-0.860 66＋0.013 828A＋0.003 249B＋0.055 85C（R2＝0.384 0，P＝0.046 5）、Y＝-4.150 96 ＋0.092 55A＋0.044 78B＋0.138 1C-0.000 234 3AB-0.009 839AC＋0.000 055 62BC＋0.000 302 1A2-0.000 337 5B2＋0.020 36C2（R2＝0.701 7，P＝0.075 3），可知二項式方程R2明顯高于多元線性回歸方程，故本實(shí)驗選擇其優(yōu)化提取工藝。方差分析見表6，可知各因素影響程度依次為A＞C＞B，其中A有顯著影響（P＜0.05）。響應(yīng)面分析見圖1。

表5 試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.5 Design and results of tests

表6 方差分析Tab.6 Analysis of variance

圖1 各因素響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

由此確定，最優(yōu)提取工藝為加熱回流提取2 次，第1 次加10 倍量60%乙醇，第2 次加8 倍量60%乙醇，每次45 min。再按照上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗證試驗，測得OD值分別為0.764 1、0.780 3、0.763 0，平均0.769 1，RSD 為1.26%，表明工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性良好。

3 討論

壯藥金母方原劑型為湯劑，但因其服用、保存不便，故將其制成顆粒劑。該方主要用于治療慢性盆腔炎，其病因為前期細(xì)菌感染、反復(fù)發(fā)作而形成炎癥［10］，方中主藥金剛刺、土茯苓主要成分為落新婦苷，虎杖主要成分為虎杖苷，兩者均具有抗炎抑菌的作用，可反映全方有效性［11?15］，故本實(shí)驗以抗炎、抑菌活性為主要考核指標(biāo)來篩選提取溶劑。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)會對安全性、生產(chǎn)成本產(chǎn)生影響，故本實(shí)驗又通過操作簡便的體外抑菌實(shí)驗來篩選其體積分?jǐn)?shù)。

中藥復(fù)方制劑臨床療效是方中各藥材發(fā)揮協(xié)同作用的結(jié)果，故方中單一成分不能全面反映其整體性和有效性。目前，常選擇有效成分含有量、干膏得率的加權(quán)綜合評分作為評價指標(biāo)［16?18］，故本實(shí)驗采用虎杖苷、落新婦苷含有量及干膏率來綜合評價金母顆粒提取工藝的優(yōu)化效果。

另外，以抗炎、抑菌活性為主要考核指標(biāo)時，金母顆粒最優(yōu)提取溶劑為60%乙醇；以虎杖苷、落新婦苷含有量為主要考核指標(biāo)時，乙醇最優(yōu)體積分?jǐn)?shù)為70%，兩者不一致。最終確定，以抗炎、抑菌活性為主，從而突出基于該方藥效的核心地位。