高溫漆酶產(chǎn)生菌Bacillus thuringiensis strain Lac-72的篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究

李雪英,王建蝶,黃畢生,廖少華,陳貴元

1.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,云南 大理 671003

2.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,云南 大理 671000

3.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南 大理 671000

漆酶（Laccase）是一種多酚氧化酶，廣泛存在植物、真菌和細(xì)菌中[1]。漆酶可利用分子氧作為電子受體，從而氧化多種酚類化合物，并將分子氧還原，生成水[2]。目前，對(duì)染料廢水的處理有傳統(tǒng)的物理、化學(xué)處理法和生物處理法[2]。由于染料廢水色度高、成分復(fù)雜、有機(jī)污染物含量高、進(jìn)入環(huán)境后難以降解，傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法效率低、成本高、能耗大，而且還可能造成二次污染。而生物法處理染料廢水，具有去除率高、費(fèi)用低、環(huán)境友好等特點(diǎn)。因此，近年來漆酶成為了處理染料廢水最具應(yīng)用潛力的生物酶。由于漆酶不但能脫除染料廢水的顏色，還能降解木質(zhì)素，能夠去除許多酚類物質(zhì)的毒性，由于漆酶的這些酶學(xué)特性，使得漆酶被廣泛應(yīng)用到食品加工[3]、環(huán)境污染治理[4]和造紙[5]等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域。

目前應(yīng)用于染料廢水脫色的漆酶多來源于擔(dān)子菌、子囊菌等真菌，尤以白腐真菌最為主。趙美麗[6]篩選到一株高產(chǎn)漆酶的白腐真菌，該菌株所產(chǎn)的漆酶在脫色氧化降解靛藍(lán)和金橙的研究中，發(fā)現(xiàn)該漆酶最適pH 為5.0，最佳溫度是30oC，用3.9 U·mL-1的漆酶來進(jìn)行脫色降解反應(yīng)時(shí)，420 min時(shí)脫色較完全。曾祥康[7]篩選到一株產(chǎn)漆酶的真菌Trametes trogii SYBC-LZ，在研究該菌株漆酶酶活時(shí)發(fā)現(xiàn)：Trametes trogii SYBC-LZ 漆酶要在偏酸性的條件才能具有高酶活。由于真菌漆酶最適pH 一般偏酸，這嚴(yán)重限制了漆酶在工業(yè)中的應(yīng)用[8]。因?yàn)橛猩珡U水的成分一般比較復(fù)雜，pH 變化范圍較大。與真菌漆酶相比，細(xì)菌漆酶[9]在熱穩(wěn)定性、酶促反應(yīng)pH 范圍廣等方面比真菌漆酶更有優(yōu)勢(shì)，而且細(xì)菌本身具有生長(zhǎng)代時(shí)短、易培養(yǎng)等優(yōu)勢(shì)，因此篩選出具有漆酶活性的細(xì)菌，對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行研究具有重要的意義。鑒于此，本研究從云南省大理州洱源縣牛街鎮(zhèn)一熱泉中分離到一株產(chǎn)漆酶細(xì)菌，對(duì)該細(xì)菌漆酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，為漆酶工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品 大理洱源縣牛街鎮(zhèn)熱泉的底泥，熱泉水溫72oC。

1.1.2 試驗(yàn)儀器BT224S 型電子天平（Sartorius），722E 型光分光光度儀（上海菁華儀器公司），CX31型顯微鏡（Olympus Corporation），THZ-82 恒溫水浴搖床（常州智博瑞儀器制造有限公司），立式壓力蒸汽來菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），DL-8000C 低速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），低溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器公司），PCR儀（美國(guó)ABI 公司），DYY-7C 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.1.3 試劑 酵母提取物（OXOID）、蛋白胨（OXOID）；牛肉膏、瓊脂粉、七水硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、結(jié)晶紫、葡萄糖、番紅、乙醇、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（ABTS）、愈創(chuàng)木酚等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?；蚪MDNA 提取試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購于北京天根生物技術(shù)公司。

1.1.4 培養(yǎng)基（1）富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、CuSO4·5H2O 0.032 g，定容至1000 mL，121oC 滅菌20 min；（2）愈創(chuàng)木酚PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g·L-1（煮沸30 min取濾液）、葡萄糖10 g·L-1、瓊脂20 g·L-1，pH 自然，121oC 滅菌20 min，滅菌后加入0.2 mL 愈創(chuàng)木酚；（3）LB 斜面培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、NaCl 10 g·L-1、瓊脂20.0 g、pH 7.2～7.4，121oC 滅菌20 min；（4）發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、K2HPO4·3H2O 1.5 g、MgSO4·7H2O 2.5 g，pH 7.0，定容至1000 mL，121oC 滅菌20 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)漆酶細(xì)菌的初篩 將2 g 牛街鎮(zhèn)熱泉底泥加入到50 mL 的富集培養(yǎng)基中，混勻，72oC、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)液梯度稀釋10-1至10-7后，涂布于愈創(chuàng)木酚PDA 培養(yǎng)基平板上，37oC培養(yǎng)4 d。挑取有明顯水解圈的菌落經(jīng)多次劃線分離純化，并保存于LB 斜面培養(yǎng)基，4oC 冰箱保存。

1.2.2 產(chǎn)漆酶細(xì)菌的復(fù)篩 用接種環(huán)挑取適量初篩得到的菌株接入發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（裝液量50 mL/250 mL）中，72oC、160 r·min-1搖床恒溫培養(yǎng)5 d，將培養(yǎng)好的發(fā)酵液于6000 r·min-1離心10 min，上清液即為粗酶液，測(cè)定其酶活力，以活力高低作為復(fù)篩的依據(jù)。

酶活測(cè)定原理[10]：漆酶能催化ABTS 生成穩(wěn)定的ABTS 陽離子自由基，ABTS 陽離子自由基水溶液呈淺藍(lán)色，在420 nm 波長(zhǎng)處有特性吸收。根據(jù)吸光度值隨催化時(shí)間的變化關(guān)系計(jì)算漆酶酶活。

酶活定義：在75oC 下，以每分鐘氧化1 μmol 的ABTS 所需要的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位，酶活性以U·mL-1表示。參照文獻(xiàn)[11]的方法，稍作改動(dòng)測(cè)定酶活，計(jì)算公式如下：

式中：ΔOD為t時(shí)間內(nèi)吸光度變化值；N為酶液稀釋倍數(shù)；V總為漆酶酶活測(cè)定反應(yīng)體系總體積，mL；ε為ABTS 在420 nm 處的摩爾消光系數(shù)，為3.6×104mL·mmol-1·cm-1；t為反應(yīng)時(shí)間，min；V酶為反應(yīng)添加的酶液體積，mL；l為比色皿的直徑，1 cm；103表示mmol·L-1轉(zhuǎn)換為μmol·L-1的系數(shù)。

1.2.3 菌種鑒定（1）顯微形態(tài)及生理生化特征分析，參照文獻(xiàn)[12,13]的方法開展形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)菌生理生化實(shí)驗(yàn)；（2）分子生物學(xué)鑒定：依據(jù)DNA 提取試劑盒的方法提取細(xì)菌基因組DNA。采用通用引物，27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，擴(kuò)增細(xì)菌16 S rRNA 序列。PCR 試驗(yàn)條件：94oC，預(yù)變性5 min；94oC，變性30 s，50oC 退火，45 s，72oC 延伸，100 s，循環(huán)30 次；72oC 延伸，5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠140 V，電泳1 h，按膠回收試劑盒說明書回收PCR 產(chǎn)物。將膠回收產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)公司測(cè)序，將獲得的堿基序列提交GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫，采用在線軟件BLAST 進(jìn)行堿基序列比對(duì)分析，利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 菌株最適生長(zhǎng)溫度 按接種量為1%，將菌種接于LB 液體培養(yǎng)基中，置于不同的溫度下?lián)u床培養(yǎng)48 h，然后在波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定各個(gè)溫度下菌株生長(zhǎng)的吸光值，并測(cè)定相應(yīng)培養(yǎng)溫度下發(fā)酵上清液的酶活，確定菌株的最適發(fā)酵溫度。

1.2.5 漆酶酶學(xué)性質(zhì)的研究（1）最適反應(yīng)溫度測(cè)定：參照文獻(xiàn)[10,14]的方法，本研究中漆酶酶促反應(yīng)的時(shí)間均定為3 min。根據(jù)酶活測(cè)定方法，分別測(cè)定4oC、25oC、37oC、45oC、55oC、60oC、65oC、75oC、80oC、85oC，10 個(gè)不同溫度下，酶促反應(yīng)3 min 后的酶活，以等體積的蒸餾水代替酶液為空白對(duì)照，將各溫度下測(cè)得的吸光度值之差代入公式(1)，計(jì)算酶活；（2）酶的熱穩(wěn)定性：緩沖液同上，測(cè)酶活反應(yīng)體系同上，在最適pH 下，分別取350 μL 粗酶液分裝于7 個(gè)EP 管中，置于4oC、25oC、37oC、55oC、75oC，5 個(gè)溫度下，每隔15 min，從各管中吸取50 μL 酶液，用pH 為6.0，0.15 mol/L 的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋到3 mL。在冰浴條件下迅速向各管中加入29.5 μL，0.5 mmol·L-1的ABTS 底物，充分混勻。以同體積的蒸餾水代替酶液。測(cè)定其各個(gè)溫度條件下剩余的酶活，以保溫前的酶活為參照，采用相對(duì)酶活繪制酶的熱穩(wěn)定曲線；（3）最佳pH 的測(cè)定：配制不同pH 值（4～10）的緩沖液，在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定不同pH 值對(duì)酶活力的影響，以等體積的蒸餾水代替酶液為空白對(duì)照，反應(yīng)3 min 后測(cè)定酶活；（4）金屬離子對(duì)酶活的影響：金屬離子對(duì)酶有激活或者抑制的作用。取7 mL 粗酶液，平均分裝到7 個(gè)EP 管中，每個(gè)EP 管中有酶液1 mL，取出一個(gè)EP 管作為對(duì)照，在剩下的6 個(gè)EP 管中分別加入10 μL 不同的金屬離子（K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+），使金屬離子的終濃度為1 mmol·L-1，4oC 放置過夜。向每個(gè)EP 管中加入pH 為6.0，濃度為0.15 mol·L-1的乙酸-乙酸鈉緩沖液至3 mL，在冰浴條件下迅速向每管中加入29.5 μL，0.5 mmol·L-1的ABTS 底物，充分混勻。測(cè)定各EP 管中漆酶的酶活，設(shè)定對(duì)照管的酶活為100%，其余各EP 中漆酶的酶活與對(duì)照管的酶活相比，用相對(duì)酶活表示金屬離子對(duì)酶活的影響。

1.2.6 漆酶對(duì)染料廢水的脫色（1）對(duì)孔雀石綠廢水的脫色作用：配制初始濃度為20 mg·L-1孔雀石綠模擬廢水，在波長(zhǎng)618 nm 處測(cè)定漆酶對(duì)孔雀石綠催化脫色前后的吸光度值[15]。根據(jù)OD618的變化計(jì)算漆酶對(duì)孔雀石綠模擬廢水的脫色作用。反應(yīng)總體積為4 mL，其中20 mg·L-1孔雀石綠溶液500 μL，pH 為6.0 的檸檬酸緩沖液3 mL，500 μL 粗酶液。以蒸餾水代替孔雀石綠溶液作為空白對(duì)照，在酶的最適溫度下測(cè)定漆酶對(duì)孔雀石綠染料的脫色作用，計(jì)算脫色率:

式中：ODt為反應(yīng)t時(shí)刻的吸光度值；OD0為初始時(shí)刻的吸光度值。（2）結(jié)晶紫廢水的脫色作用：參照文獻(xiàn)[15]配制初始濃度為20 mg·L-1結(jié)晶紫模擬廢水，在波長(zhǎng)557 nm 處測(cè)定漆酶催化結(jié)晶紫廢水脫色前后的吸光度值，根據(jù)OD557值的變化計(jì)算漆酶對(duì)結(jié)晶紫的脫色效率。反應(yīng)體系、檢測(cè)方法、脫色率計(jì)算等方法同孔雀綠模擬廢水脫色方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶高產(chǎn)菌株的篩選

經(jīng)含銅培養(yǎng)基富集，培養(yǎng)液梯度稀釋10-1至10-7后，涂布于愈創(chuàng)木酚PDA 固體培養(yǎng)基平板上，25oC 培養(yǎng)48 h 后。可從平板上篩選到一株產(chǎn)漆酶的菌株，命名為L(zhǎng)ac-72。在愈創(chuàng)木酚PDA 培養(yǎng)基平板上，Lac-72 菌落呈白色、圓形、不透明、且表面光滑濕潤(rùn)有光澤（圖1）。

圖1 Lac-72 菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Lac-72

2.2 菌株Lac-72 的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 通過革蘭氏染色，芽孢染色觀察，Lac-72 為革蘭氏陽性桿菌，產(chǎn)中心芽孢（圖2，3）。

圖2 Lac-72 的革蘭氏染色（100×）Fig.2 The gram staining of Lac-72(100×)

圖3 Lac-72 的芽孢染色（100×）Fig.3 The spore dyeing of Lac-72(100×)

對(duì)Lac-72 的生理生化特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)V-P 實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、明膠實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽性；乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性；葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為能利用糖，但不產(chǎn)氣。

2.2.2 16 S rRNA 基因序列及系統(tǒng)發(fā)育分析 細(xì)菌基因組DNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)電泳分析如圖4 所示。將DNA 進(jìn)行膠回收，并送生物技術(shù)公司測(cè)序，得到Lac-72 16 S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1457 bp。將16 S rRNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)Lac-72與蘇云金芽孢桿菌屬（Bacillus thuringiensis）的16 S rRNA 基因序列自然聚類。從數(shù)據(jù)庫中選出17株與Lac-72 的16 S rRNA 基因序列同源性達(dá)98%的基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5 所示。從圖中可以看出Lac-72 與Bacillus thuringiensis strain Ou2（KP125698.1）聚為一簇，相似性也最高，為99.5%，表明Lac-72 與Bacillus thuringiensis的親緣關(guān)系最近。

圖4 Lac-7216SrRNA 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)Fig.4 Electrophoresis of PCR amplified product of Lac-7216 S rRNA

圖5 基于16SrRNA 基因序列相似性的菌株Lac-72 與17 株細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain Lac-72 and 17 bacterial strainson sequence similarity of 16S rRNA

根據(jù)Lac-72 的形態(tài)及生理生化特征，結(jié)合《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]，以及Lac-72 16 S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹，將其初步鑒定為芽孢桿菌屬的一株菌，命名為Bacillus thuringiensisLac-72。

2.3 菌株的最適發(fā)酵溫度

按照實(shí)驗(yàn)方法，在波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)定不同溫度培養(yǎng)下LB 培養(yǎng)基的吸光度值，以600 nm 處的吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖6 所示。

從圖6 中可以知，30～55oC 范圍，菌體的生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而增加，55oC 時(shí)，LB 培養(yǎng)基在600 nm 下的吸光值最高，表明55oC 是菌株的最適生長(zhǎng)溫度。55oC 以后，菌體生長(zhǎng)量隨著溫度的升高而下降，菌株在75oC 下菌體還有一定生長(zhǎng)，表明菌株Lac-72 屬于典型的耐高溫菌，其最適產(chǎn)酶溫度也是55oC。

圖6 Lac-72 的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶溫度優(yōu)化Fig.6 Growth and enzyme-producing optimization of Lac-72

圖7 溫度對(duì)Lac-72 漆酶活性的影響Fig.7 Effect of temperatures on Lac-72 laccase activity

2.4 漆酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 溫度對(duì)漆酶活性的影響 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，在不同溫度下測(cè)定酶的活性（圖7）。

從圖7 可以看出，該菌株的最適溫度為75oC，當(dāng)溫度為4oC 時(shí)，仍有活性。在4～75oC，隨著溫度升高，酶活力增加，在75oC 時(shí)，酶活力達(dá)到最大值，達(dá)到56.22 U·mL-1，當(dāng)溫度超過75oC，酶活開始急劇下降，結(jié)果表明Lac-72 所產(chǎn)漆酶屬于高溫酶。

2.4.2 酶的熱穩(wěn)定性 采用ABTS 作為底物，測(cè)定其各個(gè)溫度，不同時(shí)間條件下剩余的酶活，以保溫前的那個(gè)溫度下所測(cè)得的酶活為參照，其余溫度下所測(cè)得酶活與其相比，用相對(duì)酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線（圖8）。該漆酶在4oC 及25oC 下保溫酶能夠在長(zhǎng)時(shí)間保持相對(duì)穩(wěn)定的酶活，該酶可在較低的溫度下保存。酶在75oC 保溫75 min，仍能保持25%的酶活，表明該漆酶是典型的高溫酶。

圖8 Lac-72 漆酶的熱穩(wěn)定性Fig.8 Thermal stability of Lac-72 laccase

圖9 pH 對(duì)Lac-72 漆酶活性的影響Fig.9 Effects of pH on the activity of Lac-72 laccase

2.4.3 酶的最適反應(yīng)pH 根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，在不同的pH 條件下分別測(cè)定酶活，結(jié)果如圖9 所示。

從圖9 可以看出，pH8.0 之前，漆酶活力隨著pH 值的升高而升高，在超后pH8.0，酶活力下降，表明Lac-72 漆酶的最適反應(yīng)pH 值為8.0，屬于堿性漆酶。在pH4～10 范圍內(nèi)均有活性，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，選擇pH 8.0 作為漆酶的最適反應(yīng)pH。

2.4.4 金屬離子對(duì)酶活的影響 將含各種金屬離子的酶液在4oC 中保溫過夜后，測(cè)酶活反應(yīng)體系同上，在最適溫度和最適pH 下測(cè)定各種金屬離子對(duì)酶活力的影響結(jié)果，以對(duì)照酶活為100%，添加金屬離子的酶液酶活與其相比，求出相對(duì)酶活。結(jié)果如表1 所示。

表1 金屬離子對(duì)Lac-72 漆酶活性的影響Table 1 Effect of metal ions on laccase activity of Lac-72

從表1 可以看出，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+4 種金屬離子對(duì)酶有具有激活作用，其中Cu2+激活作用最強(qiáng)。K+、Mn2+、Zn2+對(duì)酶有一定的一直抑制作用，其中K+對(duì)酶具有較強(qiáng)的抑制作用。

2.5 漆酶對(duì)染料廢水的脫色研究

為了測(cè)試菌株Lac-72 漆酶對(duì)染料的脫色能力，選擇了2 種三苯甲烷類染料（孔雀綠、結(jié)晶紫）配成模擬廢水進(jìn)行脫色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明菌株Lac-72 漆酶對(duì)孔雀石綠和結(jié)晶紫模擬廢水均具有較好的脫色效果。在漆酶最適反應(yīng)條件下，對(duì)孔雀石綠和結(jié)晶紫模擬廢水分別脫色60 min，孔雀石綠和結(jié)晶紫的脫色率可分別達(dá)到85%和72%（圖10）。

圖10 Lac-72 漆酶對(duì)孔雀石綠和結(jié)晶紫染料廢水的脫色作用Fig.10 Decolorization of malachite green and crystal violet dye wastewater by Lac-72 laccase

3 討論

目前，對(duì)漆酶的研究及應(yīng)用主要集中于真菌漆酶，而細(xì)菌漆酶的研究相對(duì)較晚。Givaudan 于1993年首次從水稻根際土壤中分離到脂固氮螺菌漆酶[17],標(biāo)志著細(xì)菌漆酶的開始。通常，真菌漆酶的最適酶活反應(yīng)pH 范圍為4～6，最適作用溫度為30～50oC[18]，這一特性限制了真菌漆酶的生產(chǎn)應(yīng)用。而細(xì)菌漆酶反應(yīng)pH 多為堿性，且范圍寬，耐熱性較真菌漆酶要好。在工業(yè)生產(chǎn)中，耐熱酶具有諸多優(yōu)勢(shì)：（1）提高酶促反應(yīng)速率，提高催化效率；（2）工業(yè)生產(chǎn)中，能降低系統(tǒng)冷卻要求，減少能耗；（3）可通過熱處理簡(jiǎn)化酶的提純，降低制備酶的成本；（4）使酶便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏。因此，廣泛開展細(xì)菌漆酶，特別是嗜熱細(xì)菌漆酶的研究具有重要意義。

嗜熱細(xì)菌（Thermophilic bacteria）通常指能在55oC 以上生長(zhǎng)的細(xì)菌，主要分布于火山口、堆肥、溫泉和工廠廢水排放口附近。嗜熱細(xì)菌所產(chǎn)的酶往往具有極強(qiáng)的耐熱性，在工業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值[19]。目前，已報(bào)道產(chǎn)漆酶的極端嗜熱細(xì)菌主要有嗜熱棲熱菌（Thermus Thermophilus）、超嗜熱菌（Aquifex aeolicus）和耐超高溫?zé)岚艟≒yrobaculum aerophilum）[20]。本研究從云南省大理州洱源縣牛街鎮(zhèn)72oC 地?zé)釡厝啄嘀泻Y選到1 株產(chǎn)漆酶的高溫菌，初步鑒定為蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis），命名為Bacillus thuringiensisstrain Lac-72。Lac-72 最適生長(zhǎng)溫度為55oC，在75oC 仍能生長(zhǎng)，是典型的嗜熱細(xì)菌，該菌所產(chǎn)漆酶最適酶活溫度為75oC，熱穩(wěn)定性較好，75oC 保溫75 min，仍能保持25%的酶活，表明該漆酶是典型的高溫酶，與Fernandes 等人報(bào)道的嗜熱漆酶Mco A 具有相似的酶學(xué)特性[21]。由于染料廢水成分復(fù)雜、色度高、pH 變化范圍較廣，真菌漆酶最適pH 一般偏酸性，而本實(shí)驗(yàn)篩選到的細(xì)菌漆酶最適反應(yīng)pH 值為8.0，在pH4～10 范圍內(nèi)均有活性，表明該菌株所產(chǎn)漆酶可以直接用于處理工業(yè)染料廢水。

金屬離子耐受實(shí)驗(yàn)表明，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Fe2+，4 種金屬離子對(duì)該酶具有激活作用，其中Cu2+激活作用最強(qiáng)。王習(xí)文等[22]認(rèn)為Cu2+可能是通過改變漆酶的結(jié)構(gòu)或者酶蛋白分子的電荷分布來影響酶的活性，在pH 大于4.5 時(shí)，Cu2+表現(xiàn)出對(duì)漆酶的活化作用。本研究結(jié)果表明，在pH 為8.0 的反應(yīng)體系中，Cu2+對(duì)漆酶有激活作用，這一結(jié)果與已報(bào)道的結(jié)果相一致[22]。K+、Mn2+、Zn2+對(duì)該酶均有抑制作用，其中Mn2+、Zn2+對(duì)該酶酶活有輕微的抑制作用，而K+對(duì)酶活的抑制作用最為顯著，可能是因?yàn)檫@幾種金屬離子誘使酶的活性中心結(jié)構(gòu)改變，使酶與底物的結(jié)合能力減弱，從而抑制了酶活。上述結(jié)果表明，該漆酶在大多數(shù)金屬離子存在下均展現(xiàn)出較好的催化活性，表明該漆酶在處理含有金屬離子的染料廢水方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

三苯甲烷類染料不是漆酶的特異底物[23]，但本研究篩選到的菌株Lac-72 所產(chǎn)漆酶對(duì)孔雀石綠和結(jié)晶紫廢水均有很好的脫色效率，表明該菌株所產(chǎn)的漆酶在環(huán)境污染治理方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

從云南省大理州洱源縣牛街鎮(zhèn)72oC 地?zé)釡厝啄嘀泻Y選得到一株產(chǎn)漆酶細(xì)菌，初步鑒定為芽孢桿菌屬的一株菌，命名為Bacillus thuringiensisLac-72。該菌株所產(chǎn)漆酶的最適作用溫度為75oC，最適酶活pH 值為8.0。在25oC 以下，能保持良好的穩(wěn)定性。K+、Mn2+、Zn2+對(duì)該酶有一定抑制作用，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Cu2+均對(duì)該酶活力起到促進(jìn)作用，其中Cu2+的促進(jìn)效果最為明顯。該酶對(duì)三苯甲烷類染料孔雀石綠和結(jié)晶紫廢水進(jìn)行脫色處理60 min，脫色率分別可達(dá)85%和72%。本研究可為細(xì)菌漆酶的開發(fā)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。