補(bǔ)骨脂素通過刺激成肌分化促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合的療效觀察

邱麗玲，金鎮(zhèn)雄，趙永見，侯彤，吳弢，高翔*，唐德志

1.復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院傷外科，上海200032；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海200032

骨質(zhì)疏松癥是一種常見性疾病，其低骨量和惡化的骨微結(jié)構(gòu)使得骨折發(fā)生的可能性增加。流行病學(xué)顯示，我國(guó)60 歲及以上婦女骨質(zhì)疏松癥發(fā)生率為53.8%，伴隨骨折的發(fā)生率為32.6%[1]。骨質(zhì)疏松癥可造成疼痛和傷殘。在歐洲，每年因骨質(zhì)疏松性骨折而花費(fèi)的醫(yī)療費(fèi)用達(dá)230 億美元[2]，給社會(huì)造成了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

骨折發(fā)生后，骨骼和肌肉均會(huì)受到損傷，肌肉修復(fù)情況會(huì)影響骨折愈合質(zhì)量。Harry 等[3]在骨折實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)被肌瓣包圍時(shí)，骨修復(fù)速度加快。隨著研究深入，研究者們發(fā)現(xiàn)肌肉骨骼系統(tǒng)遠(yuǎn)比單個(gè)組織骨骼或肌肉復(fù)雜[4]。有證據(jù)表明，骨骼和肌肉之間聯(lián)系并不局限機(jī)械偶聯(lián)，還存在分子水平關(guān)聯(lián)[5]。骨骼和骨骼肌均可分泌因子對(duì)其他組織產(chǎn)生影響[6]。因此理解骨和肌肉之間生化聯(lián)系可能給骨疾病治療提供新思路。

傳統(tǒng)理論中，腎虛是骨骼疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。補(bǔ)骨脂補(bǔ)腎溫脾，補(bǔ)骨脂素（psoralen）為其中有效成分。我們前期研究[1]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素通過調(diào)控BMP 信號(hào)通路刺激成骨細(xì)胞分化。但是補(bǔ)骨脂素對(duì)成肌分化作用尚未有報(bào)道，因此，探討補(bǔ)骨脂素對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響，有助于闡明補(bǔ)骨脂素促進(jìn)骨折愈合的具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房訂購(gòu)2月齡C57BL/6 雄鼠30 只，SPF 級(jí)飼養(yǎng)至3月齡。實(shí)驗(yàn)過程中自由飲水進(jìn)食。許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 Micro-CT（SCANCOMedical 公司,瑞士）；蘇木素染色液購(gòu)自南京建成科技有限公司；Anti-MyoD1 antibody、 Anti- MEF2C antibody、Anti-Myf5 antibody、和Anti-Myogenin antibody 均購(gòu)自美國(guó)abcom 公司；GAPDH Mouse monoclonal antibody (6004-1-lg，美國(guó)proteintech 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立骨質(zhì)疏松模型 3月齡小鼠麻醉后，平鋪在手術(shù)臺(tái)上。睪丸被推入陰囊后，在陰囊上剪口，結(jié)扎并切下睪丸，縫合傷口。

1.3.2 分組：去睪丸后3 個(gè)月，隨機(jī)分組：補(bǔ)骨脂素組、對(duì)照組，每組15 只。

1.3.3 骨折模型建立[7]：骨質(zhì)疏松術(shù)后3月，麻醉后仰臥位，剃凈鼠毛消毒，針頭由脛骨前上處插入下部骨腔，到脛骨下剪斷，抵入脛骨平臺(tái)下部分，縫合。術(shù)后連續(xù)灌胃28d，隔天1 次。

1.3.4 藥物配制（1）將20 mg 補(bǔ)骨脂素溶于20 mL 的玉米油中，震蕩混勻。（2）小鼠劑量=1/70×10×體質(zhì)量×數(shù)量×次數(shù)。2 組均以每只0.3 mL/d 藥物或生理鹽水灌胃。

1.3.5 Micro-CT 骨骼樣本固定并沖洗后，使用18 m 分辨率逐層掃描成像。

1.3.6 HE 染色 比目魚肌標(biāo)本在常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋后，使用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染液，在光學(xué)顯微鏡下觀察骨骼肌愈合情況。

1.3.7 RT-PCR 脛骨后肌中加入Trizol 和鋼珠，震蕩混勻后室溫靜置。加入氯仿，離心吸取上層水相，加異丙醇離心；加DEPC 水并檢測(cè)總RNA 濃度及吸光度值。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA。行PCR 反應(yīng)。引物序列見表1。

1.3.8 Western blotting 將脛骨后肌在液氮冷凍條件下碾成粉，加入RIPA buffer 裂解液，離心收集上清，測(cè)蛋白濃度。樣品煮沸，定量上樣后電泳；分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，膜置封閉液中1 h 后,敷一抗過夜；洗膜后二抗孵育并顯色。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白（灰度）/內(nèi)參GAPDH（灰度），并將所得數(shù)據(jù)放入Graphpad prism 繪圖。每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本均重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用LSDt 檢驗(yàn)，＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨折斷端Micro-CT 比較 三維重建圖看出，補(bǔ)骨脂素組的小鼠脛骨骨折線基本消失，較多板狀骨痂存在，骨髓腔已通。對(duì)照組小鼠骨痂仍有不同程度吸收，骨痂較疏松，見圖1。

2.2 比目魚肌HE 染色結(jié)果比較HE 染色顯示，補(bǔ)骨脂素組的肌纖維排列緊密，肌細(xì)胞較多。對(duì)照組肌纖維排列較疏松，見圖2。

表1 引物序列

2.3 成肌分化相關(guān)基因在脛骨后肌中表達(dá)情況 提取肌肉組織總RNA，RT-PCR 檢測(cè)成肌分化相關(guān)基因表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，MyoD1、MEF2C、Myf5、Myogenin 成肌分化基因在補(bǔ)骨脂素組中表達(dá)上升（＜0.05），見圖3。

2.4 成肌分化相關(guān)蛋白在脛骨后肌中表達(dá)情況 為了解成肌分化相關(guān)蛋白在脛骨后肌中表達(dá)情況，對(duì)脛骨后肌中這些標(biāo)志物蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，MyoD1、Myf5、MEF2C、Myogenin 在補(bǔ)骨脂素組中表達(dá)上調(diào)（＜0.05），見圖4、5。

3 討論

補(bǔ)骨脂素可改善去卵巢小鼠模型骨代謝水平[8]。由于骨質(zhì)疏松癥實(shí)驗(yàn)受試對(duì)象多是去卵巢，雄性動(dòng)物參與此類實(shí)驗(yàn)少，所以我們選擇雄性動(dòng)物為觀察對(duì)象。另外，由于市面上骨折實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性藥多針對(duì)破骨成骨細(xì)胞，對(duì)成肌分化研究較少，尚無針對(duì)成肌分化有說服力陽(yáng)性藥，因此實(shí)驗(yàn)未增添陽(yáng)性對(duì)照組。

中醫(yī)中并無對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折明確論述。由于骨折為骨質(zhì)疏松疾病并發(fā)癥，因而可歸為“骨痹”、“骨萎”等范疇。雖傳統(tǒng)文獻(xiàn)無從脾論治記載，但有脾-肌肉-骨緊密聯(lián)系的認(rèn)識(shí)。骨肉不相親理論正是對(duì)骨骼和肌肉之間關(guān)系的概括。腎為先天之本，主骨生髓。腎髓充實(shí)滋潤(rùn)四肢百骸。脾是后天之本，主肌肉和運(yùn)化水谷。脾功能正常，氣血生化有源，化生津液輸布全身。灌溉五臟六腑，滋潤(rùn)肌肉骨骼。脾腎失常，骨骼和肌肉失去濡養(yǎng)[8]。一些研究者認(rèn)為，骨骼與肌肉關(guān)系不局限于機(jī)械偶聯(lián)，還有分子水平聯(lián)系[9]。骨可作為內(nèi)分泌器官釋放骨鈣素等因子，增加未羥丙基化骨鈣素在血液中水平，對(duì)肌肉強(qiáng)度產(chǎn)生直接影響[10]。此外，骨細(xì)胞分泌的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（Fibroblast Growth Factor 23 ，F(xiàn)GF23 ）在血液循環(huán)中水平升高導(dǎo)致了心肌肥厚[11]。Hamrick 等[12]利用肌生長(zhǎng)抑素缺陷模型研究肌肉質(zhì)量增加對(duì)骨礦物含量的影響。他們發(fā)現(xiàn)，肌肉體積增大促進(jìn)肌因子分泌，進(jìn)而影響骨量。這些研究為骨與肌肉干擾提供了有力證據(jù)?？傊?，闡細(xì)胞（activated satellite cells,ASCs）。QSCs 特征是Pax7 表達(dá)，而非MyoG 或MyoD。在增殖過程中，分裂的衛(wèi)星細(xì)胞通過上調(diào)MyoG 和下調(diào)Pax7，進(jìn)到分化階段，退出細(xì)胞周期，產(chǎn)生成肌細(xì)胞并相互融合成肌管，修復(fù)受損肌肉[13]。有研究[13]報(bào)道，MyoD-/-突變的小鼠由于延遲性肌源分化使肌肉質(zhì)量減少。另外，這些小鼠體內(nèi)成肌細(xì)胞并不能分化，也不能融合成肌管。這表明MyoD 表達(dá)是肌源性分化重要決定因素。成肌分化誘導(dǎo)主要依賴MyoD，其他肌源性調(diào)節(jié)因子也參與成肌分化。這些因子不僅對(duì)ASCs 調(diào)控基因表達(dá)程序起關(guān)鍵作用,而且在骨骼肌微環(huán)境中信息處理、肌肉形態(tài)等方面有重要影響[14]，因?yàn)樗鼈冋T導(dǎo)的絕大部分靶基因是肌肉特異性結(jié)構(gòu)和收縮性基因。因而我們選擇MyoD1、MEF2C、Myf5 和Myogenin作為成肌分化標(biāo)志性因子。

在微環(huán)境受到破壞后，激活的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞不僅可以融合和修復(fù)受損的肌纖維，還具有直接或間接的成骨潛力。有研究證實(shí)[15]，在沒有肌肉骨骼創(chuàng)傷的情況下，MyoD 的表達(dá)僅限于骨骼肌。骨折發(fā)生后，MyoD 系肌源性細(xì)胞便會(huì)被招募到骨損傷的位置，這可能由于骨膜破壞和局部組織創(chuàng)傷。肌肉損傷可促進(jìn)異位骨形成。研究者使用局部麻醉劑誘導(dǎo)肌肉退化，隨后衛(wèi)星細(xì)胞增殖激活。當(dāng)肌肉植入脫礦骨基質(zhì)明膠后發(fā)現(xiàn)有較強(qiáng)的骨反應(yīng)[12]。還有研究者將攜帶骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein,BMP）基因的腺病毒直接注射到比目魚肌中。相關(guān)染色反應(yīng)顯示肌纖維內(nèi)有較強(qiáng)骨形成標(biāo)志物受體表達(dá)[13]。這表明衛(wèi)星細(xì)胞能夠?qū)MP 刺激做出反應(yīng)，從而產(chǎn)生成骨反應(yīng)。利用這種現(xiàn)象，人們也許可以通過物理或化學(xué)方式誘導(dǎo)骨損傷附近肌肉創(chuàng)傷，增加成骨反應(yīng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)使用去睪丸骨折模型，研究補(bǔ)骨脂素對(duì)成肌分化標(biāo)志性基因的影響，從成肌分化角度動(dòng)態(tài)觀察脛骨和肌肉修復(fù)情況。結(jié)果表明，補(bǔ)骨脂素提高成肌分化特異性基因表達(dá)水平，刺激肌肉修復(fù)，加快骨質(zhì)疏松性骨折骨痂形成。一方面通過刺激衛(wèi)星細(xì)胞分化，加快骨骼肌和骨骼修復(fù)。另一方面，補(bǔ)骨脂素補(bǔ)先天精氣、促脾胃運(yùn)化，使藥物更有效被吸收發(fā)揮作用。本研究以中藥改善骨質(zhì)疏松性骨折患者生活質(zhì)量為關(guān)注點(diǎn)，旨在為醫(yī)者提供新思路。然而，本次實(shí)驗(yàn)中也存在一些不足。首先對(duì)脛骨標(biāo)本做了Micro-CT，未有皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨定量數(shù)據(jù)，如皮質(zhì)骨松質(zhì)骨厚度、骨礦物含量，這些會(huì)使實(shí)驗(yàn)更有說服力。其次，藥物劑量單一，補(bǔ)骨脂素促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合和其量效關(guān)系之間機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步研究。