理氣散結(jié)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

魏譚軍 肖成 魏旭 陳飛 周殿儒 程闊菊 王毅

(四川省達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川達(dá)州 635000)

理氣散結(jié)顆粒為醫(yī)院制劑，由理氣散結(jié)丸（批準(zhǔn)文號：川藥制字Z20 070503；標(biāo)準(zhǔn)號：四川省食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)SZBZ20070502-12[1]）改進(jìn)而來，原丸劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對方中延胡索進(jìn)行了顯微鑒別，亟待完善。該研究不僅采用TLC 對方中白芍、柴胡等進(jìn)行定性鑒別，還通過HPLC 對方中芍藥苷進(jìn)行含量測定，按照《中國藥典（2015 版）》對理氣散結(jié)顆粒進(jìn)行顆粒劑項(xiàng)下相關(guān)檢查[2]，旨在為建立該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

儀器：Agilent 1100 型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；BT 25S 十萬分之一電子天平（賽多利科學(xué)儀器北京有限公司），AotoScience As20500T超聲波提取儀（無錫沃信儀器有限公司）。

試藥：芍藥苷（批號110736-201438，中國食品藥品檢定研究院）；理氣散結(jié)顆粒自制（批號分別為20151125、20151126、20151127）。

方法 ：薄層色譜法鑒別方中柴胡、延胡索、甘草、青皮、當(dāng)歸及白芍；高效液相色譜法測定芍藥苷的含量并定限；按照《中國藥典（2015 版）》規(guī)定的方法性狀、粒度、溶化性、裝量差異及微生物限度進(jìn)行檢查。

2 結(jié)果

2.1 制法

稱取白芍、柴胡等10 味中藥飲片加12 倍量水浸泡0.5h，煎煮1h，煎煮過程中收集芳香水；第二次加10 倍量水煎煮1h，同時(shí)收集芳香水；第三次加8 倍量水煎煮1h，同時(shí)收集芳香水。三次水提液合并后濃縮至相對密度為1.20～1.40(60℃)的稠浸膏，芳香水經(jīng)水蒸氣蒸餾法繼續(xù)提純。取稠浸膏1份，蔗糖粉3 份，糊精1 份（稠膏：蔗糖粉：糊精=1:3:1），混勻，制粒，干燥（70℃），噴加揮發(fā)油，混勻，低溫干燥，制成1000g，即得[3,13]。

2.2 性狀

對三批樣品進(jìn)行觀察，樣品為黃棕色至棕褐色顆粒；氣微香，味甜，微苦。

2.3 TLC 鑒別[4]

2.3.1 柴胡薄層鑒別

以柴胡對照藥材為對照，以乙酸乙酯-乙醇-水（8:2:1）為展開劑，硅膠G 薄層板上展開，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)和熒光斑點(diǎn)。而陰性對照溶液色譜中無相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果斑點(diǎn)清晰圓整，Rf 值適中，用以驗(yàn)證三批樣品重現(xiàn)性好，故收入標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 柴胡TLC 圖（日光與紫外燈下）

2.3.2 延胡索薄層鑒別

以延胡索對照藥材為對照，以環(huán)己烷-乙醚-三氯甲烷（3:5:0.5）為展開劑，硅膠G 薄層板上展開，置碘缸中約3min 后取出，揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。而陰性對照溶液色譜中無相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果斑點(diǎn)清晰圓整，Rf 值適中，用以驗(yàn)證三批樣品重現(xiàn)性好，故收入標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 延胡索TLC 圖

2.3.3 當(dāng)歸薄層鑒別

以當(dāng)歸對照藥材為對照，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-冰乙酸（6:5:2:1）為展開劑，硅膠G 薄層板上展開，置紫外光燈（365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。而陰性對照溶液色譜中無相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果斑點(diǎn)清晰圓整，Rf 值適中，用以驗(yàn)證三批樣品重現(xiàn)性好，故收入標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.4 白芍薄層鑒別

以芍藥苷對照，以三氯甲烷-甲醇（4:1）為展開劑，硅膠G 薄層板上展開，噴5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色淸晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對照溶液色譜中無相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果斑點(diǎn)清晰圓整，Rf 值適中，用以驗(yàn)證三批樣品重現(xiàn)性好，故收入標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 當(dāng)歸TLC 圖

圖4 白芍TLC 圖

2.3.5 青皮薄層鑒別

以橙皮苷對照，以三氯甲烷-甲醇-水（32:17:5）下層溶液為展開劑，硅膠G 薄層板上展開，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，而陰性對照溶液色譜中無相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果斑點(diǎn)清晰圓整，Rf 值適中，用以驗(yàn)證三批樣品重現(xiàn)性好，故收入標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.6 甘草薄層鑒別

圖5 青皮TLC 圖

以甘草對照藥材對照，以三氯甲烷-甲醇-水（13:6:2）為展開劑，硅膠G 薄層板上展開，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色淸晰，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。而陰性對照溶液色譜中無相應(yīng)的斑點(diǎn)。結(jié)果斑點(diǎn)清晰圓整，Rf 值適中，用以驗(yàn)證三批樣品重現(xiàn)性好，故收入標(biāo)準(zhǔn)。

圖6 甘草TLC 圖

2.4 檢查

2.4.1 性狀：本品為黃棕色至棕褐色的顆粒；味甜、微苦

2.4.2 粒度：按照《中國藥典（2015 年版）》四部粒度和粒度分布測定法（通則0982 雙篩分法）測定三批樣品（批號：151125、151126、151127），結(jié)果見表1。

結(jié)果符合《中國藥典（2015 年版）》規(guī)定，結(jié)合藥典要求，理氣散結(jié)顆粒劑粒度暫定為不過1 號篩與過5 號篩總和不超過15%。

表1 理氣散結(jié)顆粒三批樣品粒度測定表

2.4.2 水分 ：按照《中國藥典（2015 年版）》四部，水分測定法（通則0832）甲苯法測定三批樣品（批號：151125、151126、151127），除另有規(guī)定外，水分不得超過8.0%。甲苯法，結(jié)果如表2。

表2 理氣散結(jié)顆粒三批樣品水分測定表

結(jié)果符合《中國藥典（2015 年版）》規(guī)定，結(jié)合藥典要求，理氣散結(jié)顆粒劑裝量含水量暫定為不超過8%。

2.4.3 溶化性：照《中國藥典（2015 年版）》四部，顆粒劑溶化性測定，取本品10g，加熱水200ml，攪拌5 min，立即觀察，可溶顆粒應(yīng)全部溶化或輕微渾濁。照上述方法測定三批樣品，結(jié)果符合藥典規(guī)定。

2.4.4 裝量差異：按照《中國藥典（2015 年版）》四部（通則0104）顆粒劑項(xiàng)下裝量差異檢查法測定三批樣品（批號：151125、151126、151127）。結(jié)果如表3。

表3 理氣散結(jié)顆粒三批樣品裝量差異測定表

2.4.5 微生物限度 ：按照《中國藥典（2015年版）》附錄ⅩⅢC，顆粒劑微生物限度檢查測定三批樣品（批號：151125、151126、151127）。檢測結(jié)果如表4。

表4 理氣散結(jié)顆粒三批樣品微生物限度測定表

2.5 含量測定[5-9]

理氣散結(jié)顆粒是由白芍、柴胡等組成，白芍為方中君藥，主要含有芍藥苷，本標(biāo)準(zhǔn)參考中國藥典，建立高效液相色譜法測定本品中芍藥苷的含量，并進(jìn)行方法學(xué)考查。試驗(yàn)中采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相；檢測波長為230nm。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。試驗(yàn)證明：該方法準(zhǔn)確，可靠，操作簡便，故收入正文。

2.5.1 色譜條件

色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Diamansil C18 柱(4.6 mm×250 mm,5 μ m)；流動(dòng)相乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脫（表5），柱溫30℃，流速1 mL·min-1，檢測波長230 nm；進(jìn)樣量5 μL。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)應(yīng)不低于2000，峰形良好，其保留時(shí)間芍藥苷約為12min，芍藥苷與相鄰峰的分離良好(Rs＞1.5)，陰性對照品溶液無干擾（圖7）。

表5 理氣散結(jié)顆粒流動(dòng)相洗脫程序表

2.5.2 線性關(guān)系的考查

對照品溶液的制備：取干燥至恒重的芍藥苷對照品6.36mg 置于100ml 容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得63.6μg/ml 芍藥苷對照品溶液。

圖7 理氣散結(jié)顆粒高效液相色譜圖

表6 芍藥苷對照品線性關(guān)系考查測定結(jié)果

分別精密吸取上述溶液2、4、6、8、10μl，注入液相色譜儀測定，記錄峰面積，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表6，得回歸方程Y=1.19749568x-3.7390238，r=0.99983(n=5)。結(jié)果表明芍藥苷進(jìn)樣量在0.1272-0.6360μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度考察

精密吸取線性關(guān)系考查項(xiàng)下對照品溶液（芍藥苷63.6 μg/mL）5μL，連續(xù)進(jìn)樣5 次，結(jié)果見表7，RSD=1.58318%，表明精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性考察

表7 精密度試驗(yàn)結(jié)果

供試品溶液的制備：取本品1.5g，置50ml 容量瓶中，加稀乙醇溶解至刻度，超聲30min，搖勻，過微孔濾膜(0.45 μ m)，即得。對同一批樣品（批號151125）分別取樣6 份，平行兩次，按上述的含量測定方法進(jìn)行測定，平均含量2.4038mg/mL，RSD=0.250%，結(jié)果表明本法具有良好的重現(xiàn)性，見表8。

表8 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.5 準(zhǔn)確度考察

精密量取已知含量（芍藥苷含量2.49mg/g）的樣品0.75g，分別加入芍藥苷對照品適量，按前述成品供試品溶液的制備方法及色譜條件進(jìn)行測定，以下列公式計(jì)算回收率，結(jié)果表明：本法回收率良好，見表9。

表9 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.6 穩(wěn)定性考察

分別精密吸取對照品、供試品溶液5μL，于0h、1h、2h、4h、6h、8h、24h，注入高效液相色譜儀，測定芍藥苷的峰面積，結(jié)果見表10、11，峰面積RSD=0.58%（n=5），表明供試品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.7 樣品的測定

取三批中試樣品(151125、151126、151127)，按前述擬定的含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表12，根據(jù)測定結(jié)果，結(jié)合實(shí)際情況及生產(chǎn)出現(xiàn)的誤差，故本標(biāo)準(zhǔn)暫定本品每g 含芍藥苷計(jì)，不得少于2.3687×80%mg，即不得少于1.89mg。

表10 對照品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表11 供試品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表12 樣品中芍藥苷的測定結(jié)果

3 討論

臨床使用20 余年的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑理氣散結(jié)丸，由于其為藥材打粉后制成大蜜丸，故服用劑量大（每丸重9g，每次2～3 丸，每日3 次），微生物易超標(biāo)，口感差、運(yùn)輸攜帶保存不便、起效緩慢，同時(shí)輔料蜂蜜含雌激素促進(jìn)乳腺增生，給患者帶來不便，故將理氣散結(jié)丸改劑型為理氣散結(jié)顆粒。按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊管理辦法》《四川省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究技術(shù)指南》的要求對工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性進(jìn)行規(guī)范研究[11-12]，旨在提高原有醫(yī)院制劑理氣散結(jié)丸的質(zhì)量及順應(yīng)性，獲得一種生物利用度高、服用量小、順應(yīng)性好、攜帶方便的醫(yī)院制劑-理氣散結(jié)顆粒。

理氣散結(jié)顆粒由白芍、柴胡、香附、延胡索、青皮、當(dāng)歸等10 味中藥材加10 味中藥材經(jīng)提取濃縮成稠膏后，再加入蔗糖、糊精等輔料加工而成[3-5]。通過薄層色譜法對方中柴胡、白芍、青皮、甘草等其他藥味進(jìn)行定性鑒別：斑點(diǎn)清晰圓整，Rf 值適中；采用高效液相色譜法對芍藥苷進(jìn)行含量測定并定限：本品每g 含芍藥苷計(jì)，不得少于1.89mg，完善了理氣散結(jié)顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。HPLC 測定芍藥苷含量時(shí)，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液共4 個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，最終以乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相時(shí)色譜峰的分離度較好且基線平穩(wěn)，有利于特征峰的分析[13-15]。