自擬活血益氣滋陰方對糖尿病周圍神經(jīng)病變患者NLRP3炎性小體及下游炎癥因子水平的影響

王志敏 李建欣 白 艷

糖尿病周圍神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病患者常見的并發(fā)癥之一，在2型糖尿患者中發(fā)生率能達到60%～90%[1]，其發(fā)生與糖尿病患者機體慢性炎癥反應密切相關[2]。NLRP3炎性小體是一種存在于細胞質中的蛋白復合物，依賴半胱天冬蛋白酶-1(caspase-1)的分子平臺促進白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-18的成熟和釋放，并引起炎癥反應[3]。研究[4]指出，NLRP3炎性小體激活是糖尿病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)之一，一旦體內對NLRP3炎性小體的調控失衡，可能生成過量的IL-1β、IL-18，引發(fā)一系列的糖尿病并發(fā)癥。西醫(yī)治療DPN主要以降糖、降脂、營養(yǎng)神經(jīng)、改善微循環(huán)等綜合性治療，但由于DPN的發(fā)病機理尚不十分明確，影響因素復雜多樣，目前仍缺乏有效的治療方法。在中醫(yī)范疇中，糖尿病被稱為消渴癥，基本病機是陰虛為本，燥熱為標，故清熱潤燥、養(yǎng)陰生津為本病的治療核心宗旨。既往研究[5，6]證明，益氣活血滋陰治療糖尿病相關并發(fā)癥，可以有效緩解并發(fā)癥相關癥狀，改善相關指標水平，提高患者的生存質量，但目前此方面的研究尚無關于是否能改變炎性指標的結論。因此，我院在常規(guī)治療的基礎上，結合自擬活血益氣滋陰方治療DPN患者，觀察NLRP3及其下游炎癥因子的水平變化，旨在為臨床應用提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2019年1月—2019年12月于我院住院治療的DPN患者152例，其中，男84例，女68例；年齡38～65歲，平均年齡(57.46±6.57)歲；病程4.5～11年，平均病程5.68(2.30，9.91)年。采用隨機數(shù)字表法，將研究對象隨機分為研究組和對照組均76例，2組性別比例、年齡、糖尿病病程、體質量指數(shù)(BMI)、血糖控制情況等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性(P>0.05)，見表1。本研究設計符合《赫爾辛基宣言》標準。

表1 2組患者一般資料比較 [例，

1.2 診斷標準T2DM和DPN西醫(yī)診斷符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年)》[7]診斷標準：①明確的糖尿病病史；②診斷糖尿病時或之后出現(xiàn)的神經(jīng)病變；③臨床癥狀和體征與DPN的表現(xiàn)相符；④有臨床癥狀(疼痛、麻木、感覺異常等)者，5項檢查(踝反射、針刺痛覺、震動覺、壓力覺、溫度覺)中任1項異常；無臨床癥狀者，5項檢查中任2項異常，臨床診斷為DPN。中醫(yī)診斷符合《糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)防治指南》標準[8]：①有糖尿病病史或診斷糖尿病的證據(jù)；②出現(xiàn)感覺、運動神經(jīng)病變的臨床表現(xiàn)；③神經(jīng)電生理檢查異常改變，物理學檢查、感覺定量試驗和神經(jīng)傳導速度中至少2項異常。

1.3 納入標準①年齡>18歲；②T2DM和DPN診斷符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年)》[7]診斷標準；③中醫(yī)診斷符合《糖尿病周圍神經(jīng)病變中醫(yī)防治指南》[8]標準；④簽署知情同意書。

1.4 排除標準①合并其他原因引起的神經(jīng)病變；②合并嚴重動靜脈血管性病變；③合并惡性腫瘤、嚴重心血管疾病、嚴重肝腎功能不全；④因藥物引起神經(jīng)毒性和代謝毒物造成神經(jīng)損傷；⑤1型糖尿病、特殊類型糖尿病；⑥對試驗藥物過敏；⑦妊娠期和哺乳期女性。

1.5 方法

1.5.1 治療方法2組均接受常規(guī)降糖、降壓、降脂、改善微循環(huán)及飲食運動干預等基礎治療。對照組在此基礎上給予甲鈷胺片(華北制藥股份有限公司，國藥準字H20031126)口服，3次/d，每次0.5 mg。研究組在基礎治療的同時，聯(lián)合使用活血益氣滋陰方湯劑，藥物組成：生姜180 g，麥冬100 g，五味子80 g，川芎60 g，當歸60 g，熟地黃60 g，人參60 g，桂心60 g，炙甘草60 g，遠志60 g，龍骨60 g，黃芪30 g，茯苓30 g，大棗20枚，羊腎1枚。制作過程為先煮羊腎，取汁煎余下藥材，早晚各服用1次，30 d為一個療程，連用3個療程(3個月)。

1.5.2 觀察指標分別于干預前、干預1個月及干預3個月后，收集相關指標。①Western blot檢測NLRP3和Caspase-1水平：收集患者空腹肘靜脈血5 ml，采用磁珠復篩法分離外周血單核細胞，試劑盒購自上海澳賽爾斯生物技術有限公司，將細胞濃度調整至5×105個/ml備用，整個操作嚴格按照說明書進行。采用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS，HyClone公司)清洗細胞并離心3次，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后用細胞裂解液提取總蛋白，收集細胞沉淀及裂解液，BCA蛋白定量。然后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜后，5%脫脂奶粉(TTBS緩沖液配置)封閉，4 ℃孵育過夜。分別加入NLRP3、Caspase-1及β-actin一抗(5%脫脂奶粉，1∶1000)，37 ℃孵育4 h，TTBS洗膜，后加入二抗(1∶50000)，37 ℃孵育1 h，TTBS洗膜，加入ECL試劑，曝光，顯影，定影，采用Gel-protein軟件分析條帶灰度。②酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測IL-1β和IL-18的表達水平：收集空腹肘靜脈血5 ml，室溫靜置，離心分離血清，并置于-80 ℃冰箱保存，采用ELISA檢測IL-1β和IL-18的表達水平，試劑盒由加拿大MyBioSource公司生產(chǎn)，購自武漢華美生物工程有限公司，操作步驟嚴格按照使用說明書進行，批間與批內的變異系數(shù)均<10%。

1.5.3 質量控制患者每月于門診復診時，門診醫(yī)師根據(jù)患者檢測結果進行常規(guī)治療方案調整，并給予飲食運動教育，但甲鈷胺及中藥方劑治療方案持續(xù)3個月。在觀察期間出現(xiàn)糖尿病急性并發(fā)癥、急性感染、嚴重外傷、家中出現(xiàn)變故等應激事件者，為避免對數(shù)據(jù)的影響導致結果的偏差，故以上情況患者數(shù)據(jù)不納入最終的統(tǒng)計。研究中涉及的Western blot實驗及ELISA檢測均在濮陽醫(yī)學高等?？茖W?；A實驗室內完成，由李建欣教授指導，所有操作嚴格按照產(chǎn)品使用說明書進行，批內及批間差異<10%。

2 結果

2.1 2組患者不同時間點NLRP3表達水平的比較重復測量的方差分析顯示，不同時間點NLRP3表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F時間=117.372，P<0.001)；對照組和研究組不同時間點NLRP3表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F組間=89.341，P<0.001)；測量前后與干預之間存在交互效應(F交互=45.662，P<0.001)，見表2。

表2 2組患者不同時間點NLRP3表達水平的比較 (例，

2.2 2組患者不同時間點炎癥因子水平的比較重復測量的方差分析顯示，不同時間點Caspase-1、IL-1β及IL-18表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F時間=105.441、117.384、129.516，P<0.001)；對照組和研究組不同時間點Caspase-1、IL-1β及IL-18表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F組間=67.376、46.364、58.610，P<0.001)；測量前后與干預之間存在交互效應(F交互=27.348、25.358、16.555，P<0.001)，見表3。

表3 2組患者不同時間點炎癥因子水平的比較 (例，

3 討論

NLRP3炎性小體是核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族NALP組成員之一，與許多炎性疾病有關，如阿爾茲海默癥、心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病等[9]。研究[10]指出，NLRP3炎癥小體及其下游炎癥因子激活是糖尿病發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，在糖尿病慢性并發(fā)癥中，受到細胞內特定信號刺激時，NLRP3發(fā)生寡聚化，通過PYD結構域招募凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)及下游的Caspase-1形成多蛋白復合物，是炎性免疫反應的重要組成部分，其主要作用是誘導后者自我剪切成活化的Caspase-1，促進IL-lβ和IL-18激活，產(chǎn)生成熟的具有活性的IL-lβ和IL-18，促進其他炎性細胞因子的合成和釋放，放大局部和全身炎癥反應，這其中氧化應激發(fā)揮出了非常重要的作用。因此，NLRP3炎性小體成為近年來糖尿病慢性病并發(fā)癥研究的“新靶點”。

目前，DPN的發(fā)病機制尚未完全闡明，對于DPN的預防和治療造成了一定的影響，但普遍認為其與糖脂代謝異常、炎癥反應、氧化應激、微血管病變有關。由于NLRP3炎癥小體在糖尿病慢性并發(fā)癥中的重要地位，尋找靶向于NLRP3炎癥小體的治療藥物就具有深遠意義。中醫(yī)學對于DPN治療具有悠久的歷史，其在中醫(yī)學中被歸為“痹證”“血痹”“痿證”等治療范疇，認為該病主要是由于患者消渴日久，耗損氣陰、真陰日益衰損繼而及陽，最終導致陰陽氣血虛弱，營衛(wèi)失調、陽虛則血行無力，瘀血凝滯脈絡，阻礙血氣正常運行，使其不能上達四末而至脈絡損傷，臨床表現(xiàn)為“麻、涼、痛、痿”。中醫(yī)學[11]認為，氣虛血瘀始終貫穿于DPN發(fā)展的始終，其中病機是氣陰皆虛、夾以血淤，本虛證和標實證動態(tài)演變，氣虛是遷移不愈的癥結，血瘀是造成本病的主因。因此，本病的臨床治療離不開益氣、活血、滋陰等療法[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過3個月的干預后，2組NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達水平均降低，提示經(jīng)過常規(guī)的降糖、降脂、營養(yǎng)神經(jīng)、改善微循環(huán)的治療后，DPN患者炎癥狀態(tài)得到了一定的改善，進一步觀察發(fā)現(xiàn)，研究組患者1個月和3個月時，Caspase-1、IL-1β及IL-18表達水平低于對照組(P<0.001)，說明給予活血益氣滋陰方治療后，效果更為明顯。中藥具有雙向調節(jié)、多靶點、多途徑的優(yōu)點，目前關于中藥復方干預NLRP3炎癥小體的研究較少。既往研究[6]證實，益氣活血中醫(yī)治療能夠改善DPN患者氣虛血瘀癥狀，緩解局部不適，效果好于甲鈷胺單藥治療?；钛鏆庾剃幏皆谂湮樯蠂栏褡裱熬?、臣、佐、使”的要求，以補陰為主，氣陰同治，兼顧痰瘀，清化濕熱，注重脾運，以達到五臟六腑通達平和的良好狀態(tài)。在方劑中，君為黃芪、麥冬，補氣固表、滋陰補血。黃芪可補中益氣，改善營血虛滯，其藥理成分中的黃芪多糖可清除自由基，抗脂質氧化，保護線粒體的結構和功能，在機體抗氧化應激中起重要作用[13]。麥冬具有滋陰生津、健脾益氣的功能，用于治療內熱消渴，現(xiàn)代藥理研究[14]證明，麥冬具有抗炎、抗氧化、降糖降脂的作用，其總皂苷及各部位提取物對改善炎癥均具有較好的作用。臣為熟地黃，通血脈，益氣力，主治氣血兩虛、肝腎虧虛、腎陽虛證等，其水提取液能通過上調T2DM大鼠胰島素原基因mRNA與蛋白的表達和抑制脂肪組織resistin基因的表達，改善胰島β細胞功能[15]，且在家兔中進行的實驗[16]證明，熟地黃可以抑制血漿cAMP含量過高及cAMP/cGMP比值過高，具有抗炎的作用。另外，方劑中再配以五味子、當歸、炙甘草、桂心、茯苓、人參、川芎等，分別歸為臣藥、佐藥、佐使藥，起到益氣生津、溫補氣血、補氣健脾、通絡活血等作用。

綜上所述，在糖尿病常規(guī)治療的基礎上給予活血益氣滋陰方，可以降低DPN患者NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子Caspase-1、IL-1β及IL-18的表達水平，但本文無法證明導致NLRP3炎性小體及其下游炎癥因子下降的具體機制，且目前中醫(yī)學在此方面的研究較少，此結論還有待進一步確定。