AM真菌對鹽脅迫下白芨生長和養(yǎng)分吸收的影響

張欣磊，邱雅靜，王艷紅，*，宋垚彬，吳愛平，蘇秀

1. 浙江農(nóng)林大學(xué)省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州 311300

2. 杭州師范大學(xué)生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與恢復(fù)杭州市重點實驗室，杭州 310036

3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128

0 前言

土壤鹽堿化是世界性的的生態(tài)環(huán)境問題之一[1-4]。我國鹽漬土總面積約 1×108hm2，主要分布在我國長江沿岸和北方地區(qū)，且受人口持續(xù)增長、工業(yè)污染突出、灌溉農(nóng)業(yè)的大力發(fā)展和化肥大量使用等因素的影響，目前土壤次生鹽堿化不斷擴展[5]。研究表明，土壤鹽漬化極大地抑制了植物根、莖、葉等器官的生長和發(fā)育[6-7]，導(dǎo)致植物受到損傷甚至死亡從而造成農(nóng)林業(yè)嚴(yán)重減產(chǎn)[8-9]。綜合已有的研究，鹽害對植物的影響主要體現(xiàn)在三個方面: ①降低土壤溶液的滲透勢，減少植物根系對水分的吸收，從而使植物遭受“生理干旱”[3，10]；②過量的 Na+和 Cl-對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，例如，破壞了酶和其他大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、使細(xì)胞器和質(zhì)膜受損，從而使光合作用、呼吸作用和蛋白質(zhì)合成等主要的代謝過程受阻[10-11]；③植物養(yǎng)分失衡，這是由于離子的選擇性吸收導(dǎo)致植物生長必須的養(yǎng)分(如N和P等)和離子的吸收或轉(zhuǎn)運受阻[3，12]。為降低土壤鹽度和減少農(nóng)林業(yè)損失，研究者們嘗試從物理、化學(xué)和工程等不同角度來改良鹽漬土和選育抗鹽或耐鹽的植物品種或通過基因工程改造的方法來培育新的抗鹽品種[13]。然而，這些方法在實施過程中，要么容易受到氣候、水分條件的嚴(yán)重限制而易造成土壤反鹽，要么歷時長且投資巨大[3]。通過生物的方法，即應(yīng)用 AM 真菌(叢枝菌根真菌——Abuscular mycorrhizal fungi，簡稱 AM 真菌)來降低鹽脅迫對植物的生長的抑制作用被認(rèn)為是最為綠色高效的方法，近些年越來越受到人們重視[12，14-19]。AM真菌是土壤中分布最為廣泛的根際微生物類群，與農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)關(guān)系最為密切，能與陸地上 80%以上的植物根系建立共生關(guān)系，形成菌根結(jié)構(gòu)[15]。國內(nèi)外研究表明，AM 真菌在鹽生環(huán)境中天然存在，且以球囊霉屬(Glomus)為主要優(yōu)勢屬，有利于提高植物的耐鹽性，促進(jìn)植物在鹽漬條件下的生長和養(yǎng)分吸收[3，12]。然而，關(guān)于AM真菌對鹽脅迫下白芨生長和養(yǎng)分吸收的影響研究則相對較少。

白芨[Bletilla striata(Thunb.) Reichb. f.]是我國傳統(tǒng)的中藥材，其地下塊根具有清熱利濕、收斂止血、消腫生肌等功效，經(jīng)濟價值高[20]。目前對白芨的研究比較有限，主要集中在種質(zhì)資源、種苗繁育、化學(xué)成分分析等方面[21-22]。浙江省具有較大面積的沿海灘涂，如何擴大白芨在鹽脅迫生境下的生長是其產(chǎn)業(yè)鏈上一個亟待解決的問題。為此，本實驗通過接種 AM 真菌，研究鹽脅迫下AM真菌對白芨生長的調(diào)控機理，以期為白芨的大面積栽培和產(chǎn)業(yè)化管理提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本實驗在浙江省杭州臨安區(qū)浙江農(nóng)林大學(xué)平山實驗基地(119°43′E，30°15′N)進(jìn)行。臨安位于浙江省西北部，為亞熱帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫為 16.4 ?C，極端最高氣溫為 41.9 ?C，極端最低氣溫為-9.2?C，全年日照時數(shù)為 1847.3 h，年平均降水量為 1628.6 mm，無霜期為 237 d，土壤為紅黃壤[23]。

1.2 供試材料

白芨(B. striata)屬多年生草本地生蘭科(Orchidaceae)白芨屬(BletillaRchb. F)植物，主要分布在貴州、廣西、安徽、四川、云南、陜西、甘肅等地，具有很強的適應(yīng)性、觀賞價值、藥用價值和經(jīng)濟價值[22]。本實驗選用健康且長勢一致的無菌培養(yǎng)的1年生白芨幼苗20株作為實驗材料。經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后，所有白芨幼苗移栽于 18 cm × 11 cm × 10 cm帶有盆托的塑料花盆中，栽培基質(zhì)為當(dāng)?shù)丶t黃壤和進(jìn)口泥炭土按3:1體積比混合均勻后過2 mm土壤篩，121?C高壓濕熱滅菌2 h，以消除基質(zhì)中的真菌孢子和其他土壤微生物，并放置兩周后使用。每盆裝混合基質(zhì) 750 g。培養(yǎng)基質(zhì)養(yǎng)分含量為: 有機質(zhì)21.94 mg·g-1，全氮 0.80 mg·g-1，全磷 0.32 mg·g-1，pH 5.68(水:土 =5:1)。供試菌種為摩西球囊霉(Glomus mosseae；BGC HUN03B)，由北京市農(nóng)林科學(xué)研究院植物營養(yǎng)與資源研究所提供。

1.3 實驗處理

采用二因素完全隨機試驗設(shè)計，設(shè)置NaCl鹽溶液處理(0 mM和200 mM)兩個水平和AM真菌接種處理(不接種和接種摩西球囊霉)兩個水平，共計四個處理組合，每個處理組合重復(fù)5次，隨機排列。其中，AM 真菌接種處理中接種物為經(jīng)高粱擴繁后制成含有孢子、菌絲及侵染根段的接種物，其用量為每盆 20 g；不接種處理中每盆施加等量的滅菌接種物和不滅菌接種物水濾液100 mL，以保證不同處理間除AM真菌以外的微生物區(qū)系保持一致[24]。幼苗生長30 d后開始鹽脅迫處理，為避免鹽溶液一次性加入對植物造成傷害，將鹽溶液分7次加入土壤中，每天每盆添加相應(yīng)濃度鹽溶液50 mL，連續(xù)添加7 d，這樣7 d后每盆添加的鹽溶液總量為350 mL，對照加等量的蒸餾水[25]。常規(guī)管理，適時澆水，每次澆水時掌握適量，盡量減少溢出，溢出的鹽溶液要重新倒回花盆內(nèi)，以保證實驗期間各處理鹽濃度的一致性。實驗期間，塑料大棚內(nèi)平均溫度為 28.6 ?C，平均濕度為65%。

1.4 指標(biāo)測定

實驗處理時間為2016年5月初至2016年10月底。收獲時將各處理組植株用蒸餾水洗凈，吸干表面水分，測定根長、基徑，并將植株分為根、莖和葉不同部分，測量其鮮重。隨機選取部分新鮮葉片，測其葉面積。葉面積的測定采用掃描儀(Epson V330，Japan)分別將各個葉片掃描成電子圖像后，應(yīng)用Image-J 軟件(1.44p；National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)測其面積[5]。同時，每個處理隨機選取若干根樣，利用Phillips和Hayman[26]改進(jìn)的方法染色，采用網(wǎng)格交叉法測定侵染率[27]。最后，將白芨其他部分和剩余根系放入65 ?C下烘至恒重并稱其各部分干重。并測量植物地上、地下兩部分的全N和全P含量。植物營養(yǎng)元素N用H2SO4-H2O2凱氏定氮法測定，全P含量用釩鉬黃吸光光度法測定[28]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

以白芨的菌根生長效應(yīng)(MGR)[29]、地下部分(白芨的藥用成分在于其地下部分)磷依賴性(MPR)、氮依賴性(MNR)[4]來量化不同鹽處理水平下菌根效應(yīng)，其計算公式如下所示:

對所測指標(biāo)采用二元方差分析(General Linear Model；GLM 過程，SPSS 23.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)研究鹽脅迫和AM真菌對白芨各相關(guān)指標(biāo)的影響。數(shù)據(jù)分析前，根長、葉面積和根干重經(jīng)平方根轉(zhuǎn)換，基徑和根冠比經(jīng) lg10轉(zhuǎn)換后符合齊性檢驗，其他指標(biāo)不經(jīng)過轉(zhuǎn)換均符合正態(tài)性和齊性檢驗。同時，采用LSD法檢驗各個處理組合之間的差異顯著性。另外，采用獨立性 t檢驗(SPSS 23.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)分析鹽脅迫不同水平對白芨菌根MGR、MPR和MNR的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌對鹽脅迫下白芨根系侵染率的影響

通過對白芨根系菌根侵染率的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫、AM真菌及其兩者交互作用均對白芨根系侵染率具有顯著或極顯著的影響(表1)。與對照鹽濃度相比，高鹽濃度下，AM真菌接種植株(簡稱AM植株；下同)的根系侵染率顯著下降了約 44.1%，說明高鹽脅迫對 AM真菌的生長具有顯著的抑制作用；不論是在對照或高鹽條件下，與未接種AM真菌的植株(簡稱 NM 植株；下同)(平均侵染率為4.11%)相比，AM 植株的根系侵染率均顯著提高(圖 1)。

2.2 AM真菌對鹽脅迫下白芨生長和養(yǎng)分吸收的影響

通過二元方差分析表明，鹽脅迫對白芨的根長、基徑、根干重和總干重均具有顯著或極顯著的影響；AM真菌根干重和總干重具有顯著影響；兩者的交互僅對總干重有顯著影響(表 1)。進(jìn)一步地，通過對總干重的分析發(fā)現(xiàn)，接種 AM真菌顯著提高了白芨的總干重，尤其是在對照鹽濃度下，與 NM 植株相比，AM 植株的總干重顯著增加了約 56.1%；然而，隨著鹽濃度增加，白芨總干重下降，在高鹽濃度下，AM 植株的總干重雖然高于NM植株，但兩者差異并不顯著，說明 AM真菌的促進(jìn)作用受到鹽脅迫的抑制(圖 2A)。鹽處理及其 AM真菌處理對白芨根冠比的作用并不明顯，說明其對白芨的生物量分配沒有明顯作用(圖2B)。

表1 白芨幼苗的相應(yīng)參數(shù)對鹽脅迫、AM真菌及其兩者交互效應(yīng)的二元方差分析的F值及其自由度Table 1 F values of Two-way ANOVA for the effects of salt stress, arbuscular mycorrhizal fungi and their interactive effects on the parameters of Bletilla striata seedlings

圖1 鹽脅迫下AM真菌對白芨幼苗根系侵染率的影響Figure 1 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)on root colonization of Bletilla striata under salt stress

圖2 鹽脅迫下AM真菌對白芨幼苗總干重(A)和根冠比(B)的影響Figure 2 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)on total dry weight (A) and root /shoot ratio (B) of Bletilla striata under salt stress

通過對地上和地下部分氮磷含量的研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對地上和地下部分的氮磷含量均有極顯著的影響；AM 真菌對地上部分氮含量和地下部分氮含量有顯著或極顯著的影響；兩者的交互作用對地上部分磷含量和地下部分的氮磷含量均有顯著或極顯著的影響(表 1)。隨著鹽濃度增加，白芨地上部分的氮含量顯著增加；另外，在對照鹽濃度和高鹽濃度下AM植株的地上部分氮含量比NM植株分別顯著增加了約10.8%和12.1%(圖3A)。類似地，隨著鹽濃度增加，地下部分的氮含量顯著增加；在對照鹽濃度下，AM植株與NM植株的地下部分氮含量沒有顯著差異而在高鹽濃度下，AM植株的地下部分氮含量比NM植株顯著降低了約9.8%(圖3B)。隨著鹽濃度增加，地上部分磷含量顯著下降；對照鹽濃度下，AM 植株的地上部分磷含量比NM植株顯著增加了約8%而在高鹽濃度下，AM植株的地上部分磷含量與NM植株差異不顯著，說明在高鹽下AM真菌對地上部分磷含量的促進(jìn)作用受到抑制(圖3C)。隨著鹽濃度增加，白芨地下部分磷含量顯著增加，尤其AM植株的地下部分磷含量在高鹽下比在對照鹽濃度下顯著增加了約20%；在對照鹽濃度下，AM 植株的地下部分磷含量比NM植株顯著降低了約10%而在高鹽濃度下，AM植株則比NM植株顯著增加了約11%(圖3D)。

進(jìn)一步地，通過對白芨總干重與各測量指標(biāo)的相關(guān)回歸分析發(fā)現(xiàn)，白芨總干重與地上部分磷含量顯著負(fù)相關(guān)而與地下部分氮含量顯著正相關(guān)(圖4)。此外，通過對 AM 菌根效應(yīng)的分析發(fā)現(xiàn)，隨著鹽濃度的升高，白芨的菌根生長效應(yīng)(MGR)雖然下降但鹽處理的效應(yīng)并不顯著(t4= 1.966，P= 0.121)；白芨的氮依賴性(MNR)顯著下降了約8倍多(t4= 3.708，P= 0.021)而磷依賴性(MPR)則顯著上升了約2倍多(t4= 14.119，P= 0.000) (圖 5)。

圖3 鹽脅迫下AM真菌對白芨幼苗地上部分氮含量(A)、地下部分氮含量(B)、地上部分磷含量(C)和地下部分磷含量(D)的影響Figure 3 Effects of arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on N concentration of shoot (A), N concentration of root (B), P concentration of shoot (C) and P concentration of root (D) of Bletilla striata under salt stress

圖4 鹽脅迫和AM真菌作用下白芨幼苗總干重與地上部分磷含量(A)和地下部分氮含量(B)的關(guān)系Figure 4 Relationship between total dry weight and P concentration of shoot (A) and N concentration of root (B) of Bletilla striata under salt stress and arbuscular mycorrhizal fungi (AMF)

圖5 不同鹽脅迫水平下接種AM真菌對白芨幼苗菌根效應(yīng)的影響Figure 5 Effects of AMF on the mycorrhizal growth response (MGR), mycorrhizal P response (MPR) and mycorrhizal N response (MNR) of Bletilla striata under salt stress

3 討論

3.1 AM真菌對鹽脅迫下白芨生長和養(yǎng)分吸收的影響

本實驗中鹽處理對白芨的侵染率和總干重生長具有顯著的負(fù)效應(yīng)(圖1和圖2)，這與以往鹽處理對胡椒(Capsicum annuumL.)[30]，羊草(Leymus chinensis)[4]，西紅柿等[31]的研究是相符的，其原因可能是植物需要消耗一定的能量來抵消鹽脅迫的影響[25]。許多學(xué)者認(rèn)為鹽脅迫對植物生長的抑制效應(yīng)在于Na+/Cl-離子毒害產(chǎn)生的直接效應(yīng)和鹽離子引起土壤/植物的滲透脅迫而導(dǎo)致的間接效應(yīng)共同作用的結(jié)果[32-33]。另外，本實驗中，接種 AM 真菌顯著提高了白芨的總干重，AM真菌對白芨生物量的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在生物量積累上，對根冠比即生物量的分配并沒有顯著影響，這與以往的研究并不相符[4，34]。接種AM真菌對白芨養(yǎng)分吸收的促進(jìn)作用主要體現(xiàn)在各個鹽處理下的地上部分N含量和高鹽脅迫下的地下部分P含量(見圖3)。AM真菌對植物生長的增強效應(yīng)究其原因，大多學(xué)者認(rèn)為是由于菌根增強了礦質(zhì)養(yǎng)分特別是難移動的 P元素的吸收[33，35]，據(jù)估計，植物吸收的P元素有將近80%是由AM真菌的根外菌絲提供的，這可能是由于與非菌根植物相比，AM 真菌的菌絲網(wǎng)絡(luò)擴大了根系在土壤中的吸收范圍[36]，但也有研究認(rèn)為 AM 真菌的效應(yīng)在于其提高了植株K元素的含量[29]。而本實驗中，對照鹽濃度下，AM真菌對白芨總干重的促進(jìn)作用很大程度上應(yīng)得益于菌根對地下部分N元素吸收的促進(jìn)作用，這與吳建新等人[37]對草莓的研究是相符的。已有研究表明，N元素吸收的提高有利于減少Na離子的毒害作用從而間接地有利于維持植物葉綠素含量[38]。

3.2 鹽脅迫下AM真菌對白芨的菌根效應(yīng)

值得注意的是，AM真菌對白芨生長的促進(jìn)作用主要是在對照鹽處理下，在高鹽濃度下(200 mM NaCl)其促進(jìn)效應(yīng)減弱(見圖2)。顯然，當(dāng)環(huán)境脅迫強度加大時，不僅植物生長受到抑制，同時還阻礙了AM 真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，進(jìn)而侵染率下降，這與本實驗中高鹽濃度下侵染率的顯著降低是相符的[11]。侵染率的高低是AM真菌功能發(fā)揮的基礎(chǔ)[39]。已有研究表明，隨著鹽脅迫的加劇，AM真菌對植物耐鹽性的促進(jìn)作用將會降低，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)閱畏交螂p方受抑制[40-41]。我們的研究表明，隨著鹽脅迫濃度的增加，白芨的菌根生長效應(yīng)(MGR)降低，這與張義飛[4]的研究并不相符，說明高鹽脅迫對 AM 真菌的生長具有一定的抑制效應(yīng)，AM真菌的存在對其生長是不利的，這可能是因為在菌根共生體系中，AM真菌雖然可以促進(jìn)宿主植物養(yǎng)分的吸收，但同時AM真菌要消耗宿主植物固定的高達(dá)20%的碳物質(zhì)，因此，在脅迫環(huán)境下，宿主植物的碳損耗大于其養(yǎng)分吸收的收益，從而導(dǎo)致菌根生長效應(yīng)下降[15]。事實上，在逆境條件下，AM和植物共生體可能面臨著各種各樣影響其互利共生關(guān)系的生物和非生物因素，其綜合作用可能會加速或削弱AM真菌對植物生長的促進(jìn)作用[11]。與此同時，白芨對N元素的依賴性(MNR)下降而對 P元素的依賴性(MPR)升高，說明隨著鹽濃度升高，白芨對N元素的依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)閷元素的依賴性，而以往對羊草的研究則發(fā)現(xiàn)隨著鹽濃度升高，植物對P的依賴性轉(zhuǎn)變?yōu)閷的依賴性[4]。在今后的研究中有必要從多個角度開展鹽脅迫下接種 AM 真菌植株的響應(yīng)格局研究，以便全面深入揭示其響應(yīng)機理。

以上研究結(jié)果表明，鹽脅迫顯著降低了白芨根系侵染率、總干重和地上部分P含量；接種AM真菌則顯著提高了白芨根系侵染率、總干重、地上部分N含量及地下部分P含量，說明接種AM真菌對白芨的抗鹽性具有一定的提高作用。尤其是，在高鹽脅迫下，接種 AM 真菌顯著提高了白芨地上部分N含量和地下部分 P含量，我國南方亞熱帶多為貧瘠的酸性紅壤[42]，這對于提高白芨產(chǎn)量及促進(jìn)白芨對礦物養(yǎng)分的吸收無疑是非常有利的，可嘗試在實際生產(chǎn)實踐中加以推廣應(yīng)用。然而，由于本實驗鹽處理水平的限制，無法獲知確切的 AM 真菌可應(yīng)用的鹽脅迫濃度范圍，在今后的深入研究中有待于設(shè)置多個鹽處理水平梯度并從多個層面揭示AM真菌對白芨生理生長的調(diào)控機理。