長鏈非編碼RNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

（紹興第二醫(yī)院 感染性疾病科，浙江 紹興 312000）

原發(fā)性肝癌為常見惡性腫瘤之一，其預(yù)后差，發(fā)病率和病死率較高。乙型肝炎病毒感染是我國主要的肝炎感染類型，乙型肝炎病毒感染是原發(fā)性肝癌的獨(dú)立危險因素和主要病因；在肝癌患者中，乙型肝炎病毒感染占全肝癌病因的70%[1]。隨著醫(yī)療水平的進(jìn)步，肝癌的診療方法不斷趨于成熟，但其術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍較高，預(yù)后較差，缺乏有效的監(jiān)測靶點(diǎn)和有效的診療是肝癌預(yù)后差的主要原因。長鏈非編碼RNA（lncRNA）具有多種生物學(xué)功能，近年來研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 參與癌基因或抑癌基因惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[2-3]。lncRNA CCHE1 在宮頸癌、甲狀腺癌等惡性腫瘤中表達(dá)升高，與甲狀腺癌等惡性腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，可作為甲狀腺癌診斷和預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CCHE1 在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，具有促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，抑制肝細(xì)胞癌凋亡的作用[6]。筆者對lncRNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌組織中的表達(dá)及在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌診斷、病情判斷及預(yù)后評估中的價值進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2012年1月—2014年12月紹興第二醫(yī)院收治的94 例乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌患者的肝癌組織及其癌旁組織。其中，男性67 例、女性27 例；平均年齡（53.64±7.14）歲；酗酒50 例；平均腫瘤直徑（5.13±1.06）cm；門靜脈癌栓25 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18 例。癌旁組織取自肝癌組織外緣3 cm 外的肝組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者進(jìn)行手術(shù)治療，均經(jīng)乙型肝炎病毒感染相關(guān)指標(biāo)及術(shù)后病理檢查證實(shí)為乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌（其對應(yīng)選取的癌旁組織經(jīng)病理證實(shí)為健康肝組織）；②術(shù)前未進(jìn)行放、化療等其他治療；③酗酒患者飲酒規(guī)律，男性平均酒精攝入量＞60 g/d，女性平均酒精攝入量＞40 g/d[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①甲、丙、丁及戊型肝炎病毒相關(guān)肝癌患者；②繼發(fā)性肝癌患者；③其他惡性腫瘤患者；④糖尿病、高血壓等其他疾病者；⑤失訪者；⑥隨訪資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批后進(jìn)行。

1.2 方法

采用RT-PCR 測定肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 的表達(dá)。將肝癌組織及癌旁組織碾碎，加入Trizol 提取總RNA（Trizol 試劑盒購自美國Sigma公司），將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國ABI 公司），進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10 min，94℃變性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共42 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參。lncRNA CCHE1 相對表達(dá)量以2-ΔΔCt法計算。CCHE1 引物正向引物：5'-AAGGTCCCAGGATACTCGC-3'，反向引物：5'-GTGTCGTGGACTGGCAAAAT-3'，長度24 bp。所有患者采取門診和電話隨訪，隨訪開始時間為手術(shù)結(jié)束當(dāng)日，隨訪結(jié)束日期為2019年12月31日或死亡日。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；繪制ROC 曲線，Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和癌旁組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 相對表達(dá)量比較

肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 相對表達(dá)量為（1.57±0.10），癌旁組織為（1.00±0.09），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=41.077，P=0.000），肝癌組織較癌旁組織高。

2.2 不同臨床病理特征患者肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 相對表達(dá)量比較

不同年齡、性別、酗酒患者肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 相對表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同腫瘤直徑、TNM 分期、門靜脈癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤直徑≥5 cm，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期，有門靜脈癌栓，及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 表達(dá)較腫瘤直徑＜5 cm，TNM 分期I、Ⅱ期，無門靜脈癌栓，及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1相對表達(dá)量比較

2.3 肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 對肝癌的診斷價值

以1.46 為診斷閾值，lncRNA CCHE1 診斷肝癌的ROC 曲線下面積（AUC）為0.814（95% CI：0.811，0.817），敏感性為72.31%（95% CI：0.693，0.734），特異性為79.24%（95% CI：0.743，0.831）。見圖1。

2.4 lncRNA CCHE1 表達(dá)與肝癌患者總生存率的關(guān)系

以lncRNA CCHE1 中位數(shù)為界將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，各47 例。隨訪5年，高表達(dá)組平均生存時間為33.02 個月，生存率為19.15%，低表達(dá)組平均生存時間為46.57 個月，生存率為46.81%。兩組生存率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.134，P=0.004），低表達(dá)組較高表達(dá)組高。兩組5年生存曲線比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.483，P=0.007）。見圖2。

圖1 肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 診斷肝癌的ROC 曲線

圖2 lncRNA CCHE1 高表達(dá)組和低表達(dá)組的生存曲線

3 討論

lncRNA 長度＞200 個核苷酸，為一種非編碼RNA[8]。在細(xì)胞所有的RNA 中，lncRNA 的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過mRNA，mRNA 占細(xì)胞所有RNA 的2%左右，lncRNA 所占比例＞90%[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)lncRNA 在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、表觀遺傳調(diào)控、劑量補(bǔ)償效應(yīng)等多種生命活動中發(fā)揮重要作用[11-12]。lncRNA 在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮重要作用，研究lncRNA 為解釋惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制帶來了新希望[13-15]。近年來lncRNA 在肝癌的發(fā)病中的作用也受到大家關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)多種lncRNA 參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程，如lncRNA HAR1A 和HAR1B 在中國乙肝病毒型肝癌中表達(dá)異常[16-19]。

筆者對乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 表達(dá)升高。lncRNA CCHE1 位于人類第10 號染色體基因上，最早發(fā)現(xiàn)lncRNA CCHE1 在宮頸癌組織中高表達(dá)，lncRNA CCHE1 過度表達(dá)導(dǎo)致宮頸癌預(yù)后不良[20]。后來發(fā)現(xiàn)lncRNA CCHE1 在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，參與多種惡性腫瘤的發(fā)病過程，如熊晶等[21]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 表達(dá)升高，乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)、預(yù)后指數(shù)相關(guān)，是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后分子標(biāo)志物；GABALLAH 等[22]發(fā)現(xiàn)lncRNA-CCHE1 在大腸癌中表達(dá)異常，與大腸癌的臨床病理特征關(guān)系密切。XU 等[23]發(fā)現(xiàn)lncRNA CCHE1 參與胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡過程；LIAO 等[24]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA CCHE1 可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖、侵襲、遷移，可以預(yù)后非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后；JIN 等[25]發(fā)現(xiàn)lncRNA-CCHE1 可參與胰腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移過程。故結(jié)合本研究結(jié)果和既往研究結(jié)果，分析lncRNA CCHE1 可能參與乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程，其原因可能與lncRNA CCHE1 具有影響惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，腫瘤直徑≥5 cm，TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期，有門靜脈癌栓，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 表達(dá)水平較腫瘤直徑＜5 cm，TNM 分期I、Ⅱ期，無門靜脈癌栓，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者高。表明肝癌組織中l(wèi)ncRNA CCHE1 相對表達(dá)量可反映患者病情的嚴(yán)重程度，分析lncRNA CCHE1 可能通過促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖，抑制惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌細(xì)胞增殖，故腫瘤直徑大者lncRNA CCHE1 相對表達(dá)量高。lncRNA CCHE1 具有促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移的作用，故lncRNA CCHE1 可能通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移，導(dǎo)致乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌的TNM 分期升高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、門靜脈癌栓等。本研究同時發(fā)現(xiàn)lncRNA CCHE1 診斷肝癌的AUC 為0.814（95% CI：0.811，0.817），敏感性為72.31%（95% CI：0.693，0.734），特異性為79.24%（95% CI：0.743，0.831）；lncRNA CCHE1 低表達(dá)組的5年生存率（46.81%）較高表達(dá)組（19.15%）高。表明lncRNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌的診斷和預(yù)后評價中具有一定的指導(dǎo)價值。本研究中，ROC 曲線評估lncRNA CCHE1 診斷肝癌的AUC 為0.814，具有較高的價值，但敏感性，特異性不高，表明其在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌的診斷中具有一定局限性，單獨(dú)靠lncRNA CCHE1 指標(biāo)進(jìn)行診斷有不足之處，在臨床上尚需結(jié)合病史及其他指標(biāo)對乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌進(jìn)行診斷，lncRNA CCHE1在乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌的診斷中具有一定的輔助指導(dǎo)價值。

綜上所述，lncRNA CCHE1 可能參與乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展，檢測其表達(dá)對乙型肝炎病毒感染相關(guān)肝癌的病情評價、診斷和預(yù)后評估中具有一定的輔助指導(dǎo)價值。