子宮內(nèi)膜癌中線粒體融合蛋白2的表達(dá)及其臨床意義*

接智慧，周巖，高翔，邵婷，張雪英

（1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，山東 泰安 271000；2.赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率僅次于宮頸癌，且有逐年上升的趨勢[1]。根據(jù)2014年我國腫瘤登記年報(bào)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中居第9 位，且患病人群呈年輕化趨勢[2]，給患者和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。雖然手術(shù)結(jié)合放療、化療及激素治療等方法使子宮內(nèi)膜癌療效提高，但晚期患者療效仍較差[3]。因此，探討子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，尋找治療新靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，線粒體融合蛋白2（Mitofusin 2,MFN2）在多種惡性腫瘤中存在差異表達(dá)，且與腫瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)[4]。但MFN2 在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系國內(nèi)外報(bào)道較少，本研究采用免疫組織化學(xué)SP 法和qRTPCR 檢測MFN2 在子宮內(nèi)膜癌組織、非典型增生組織和正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，分析MFN2 蛋白與子宮內(nèi)膜癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步探究MFN2 在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供研究基礎(chǔ)，同時為子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療提供新策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2014年1月在山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院經(jīng)病理診斷為子宮內(nèi)膜腺癌后行手術(shù)治療的72 例患者標(biāo)本作為子宮內(nèi)膜癌組。其中，年齡30 ～71 歲，平均50.5 歲；病理類型：I型60 例，Ⅱ型12 例。依照2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（Federation International of Gynaecology and Obstetrics,FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)，I、Ⅱ期41 例，Ⅲ、Ⅳ期31 例；分化程度：低分化21 例，中分化40 例，高分化11 例。另收集同期本院33 例子宮內(nèi)膜非典型增生患者的內(nèi)膜組織標(biāo)本作為非典型增生組。其中，年齡32 ～68 歲，平均51.4 歲。收集同期本院20 例因?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變Ⅲ級行全子宮切除術(shù)的正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本作為正常子宮內(nèi)膜組（包括增生期內(nèi)膜組織11 例，分泌期內(nèi)膜組織9 例）。其中，年齡38 ～50 歲，平均45.4 歲。此外，收集20 例正常子宮內(nèi)膜、23 例非典型增生和40 例子宮內(nèi)膜癌的新鮮組織，均在大體標(biāo)本離體后30 min 內(nèi)采集，立即放入液氮，然后轉(zhuǎn)入-80℃保存，行qRT-PCR 檢測。子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未行放療、化療及介入等抗腫瘤治療，納入患者（子宮內(nèi)膜癌、非典型增生、正常子宮內(nèi)膜）術(shù)前均未行內(nèi)分泌治療。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器鼠抗人MFN2 抗體購自美國Abcam 公司（貨號ab56889），免疫組織化學(xué)SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒購自福州邁新公司（貨號KIT-9730），蘇木精染色劑購自珠海貝索生物公司，Trizol 購自美國Invitrogen 公司，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國 Thermo Scientific 公司（貨號K1622），qRTPCR 檢驗(yàn)試劑盒購自珠海莫納生物科技公司（貨號MQ00201），目的基因及內(nèi)參基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。7500 型定量PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI 公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)SP 法對正常子宮內(nèi)膜、內(nèi)膜非典型增生和子宮內(nèi)膜癌組織中MFN2 的表達(dá)進(jìn)行檢測。石蠟包埋組織后進(jìn)行連續(xù)性切片，脫蠟至水后采用過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min，PBS 沖洗3 次后蛋白粉封閉2 h，將兔抗人MFN2 抗體（1∶1 000）加入后，4℃過夜，復(fù)溫后滴加二抗（1∶400），室溫孵育30 min，加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標(biāo)志物，室溫孵育10 min。PBS 沖洗后滴加DAB 顯色，復(fù)染、脫水、封片。鏡檢并拍照記錄。結(jié)果判定：MFN2 蛋白陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。染色強(qiáng)度：無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細(xì)胞比例：＜26%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例乘積判定：得分≥5 分為高表達(dá)，＜5 分為低表達(dá)[5]。結(jié)果由2 名觀察者獨(dú)立閱片判定。

1.2.3 qRT-PCR采取Trizol 一步法提取組織中總RNA，紫外分光光度計(jì)測定RNA 濃度及純度（OD 260/OD 280比值1.8 ～2.0），按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。MFN2 正向引物：5'-AACCCGGTCAT CTAACCCGT-3'，長度20 bp；反向引物：5'-TACTCCA CTATCGTTCTCTATTGAG-3'，長度25 bp。GAPDH 正向引物：5'-ACGCCTGCGCACTCGCATG-3'，長度19 bp；反向引物：5'-TAGTCGGACTGAGTTACTGC-3'，長度20 bp。qRT-PCR 擴(kuò)增體系為20μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，共計(jì)40 個循環(huán)。每一樣本重復(fù)3 次。采用2-??Ct法對MFN2 mRNA 相對表達(dá)量進(jìn)行定量分析。

1.3 隨訪

采用電話或者門診隨訪。隨訪時間為患者術(shù)后1 ～73 個月，中位隨訪時間42 個月，隨訪終點(diǎn)事件為患者死亡或者到達(dá)隨訪截止時間（2019年4月）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0 及GraphPrism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較用校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)法（α=0.0125）；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組MFN2 蛋白表達(dá)比較

MFN2 蛋白陽性表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒（見圖1），在正常子宮內(nèi)膜組、非典型增生組和子宮內(nèi)膜癌組高表達(dá)率分別為85.0%、39.4%及20.8%（見圖2），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），子宮內(nèi)膜癌組低于非典型增生組和正常子宮內(nèi)膜組（P＜0.05）。見表1。

圖1 3 組MFN2 蛋白表達(dá)情況 （SP 法×200）

圖2 3 組MFN2 蛋白免疫組織化學(xué)評分比較

表1 3 組MFN2 蛋白表達(dá)水平比較 例（%）

2.2 不同臨床病理特征子宮內(nèi)膜癌患者的MFN2蛋白表達(dá)

子宮內(nèi)膜癌組不同年齡、是否絕經(jīng)及不同肌層浸潤深度的MFN2 蛋白高表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而不同病理類型、不同分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同F(xiàn)IGO 分期的MFN2 蛋白高表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），病理類型Ⅱ型高于I型，低分化高于高分化，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)IGO 分期I、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期。見表2。

2.3 MFN2 蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系

72 例子宮內(nèi)膜癌患者中，MFN2 高表達(dá)者57 例，低表達(dá)者15 例。經(jīng)過5年隨訪，無患者失訪。Kaplan-Meier 法繪制的生存曲線結(jié)果顯示，高表達(dá)者的中位生存期為47 個月，低表達(dá)者的中位生存期為26 個月。MFN2 高表達(dá)組3年生存率為73.3%，5年生存率為33.3%；MFN2 低表達(dá)組3年生存率為38.6%，5年生存率為9.8%。兩組生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.077，P=0.008）。見圖3。

表2 不同臨床病理特征子宮內(nèi)膜癌患者的MFN2 蛋白表達(dá) 例

圖3 子宮內(nèi)膜癌患者生存曲線

2.4 3 組MFN2 mRNA 相對表達(dá)量比較

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，MFN2 mRNA 在正常子宮內(nèi)膜組、非典型增生組及子宮內(nèi)膜癌組相對表達(dá)量分別為（2.200±0.234）、（1.063±0.158）及（0.622±0.119），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=115.462，P=0.000），子宮內(nèi)膜癌組較正常子宮內(nèi)膜組、非典型增生組低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 3 組MFN2 mRNA 相對表達(dá)量比較 （±s）

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一，近30年來，其發(fā)病率逐年增加，且復(fù)發(fā)率和病死率較高[6]。盡管通過手術(shù)聯(lián)合放療、化療等綜合治療提高早期患者生存率，但是對晚期患者的治療難度仍較大，且病死率仍高居不下[7]。目前研究認(rèn)為，子宮內(nèi)膜癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，且多種危險(xiǎn)因素可誘發(fā)子宮內(nèi)膜癌，如高血壓、絕經(jīng)狀態(tài)、不孕癥及家族史等[8]。關(guān)于其機(jī)制研究較多，但尚未有統(tǒng)一定論。因此，深入研究、闡明子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制，尋找新的防治方法是目前子宮內(nèi)膜癌研究的緊迫任務(wù)。

MFN2 由定位于chr 1p 36.22 的MFN2基因編碼，含757 個氨基酸殘基，錨定于線粒體外膜的U 型跨膜蛋白[9]。目前研究表明，MFN2 在維持線粒體正常形態(tài)、調(diào)節(jié)線粒體的新陳代謝及參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)等生理功能方面有重要作用[10]。有學(xué)者研究指出，MFN2低表達(dá)與線粒體過度分裂有關(guān)，在癌細(xì)胞增殖、凋亡、代謝紊亂、細(xì)胞運(yùn)動和遷移過程中起重要作用，并且可以激活固有的（線粒體）凋亡通路，而MFN2 高表達(dá)可通過抑制線粒體分裂調(diào)控細(xì)胞存活、耐藥[11]。MFN2 表現(xiàn)出多方面的作用，目前許多學(xué)者認(rèn)為，MFN2 在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡細(xì)胞自噬中有重要作用[12]。多位學(xué)者分別在膀胱癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等腫瘤組織中證實(shí)，MFN2 在腫瘤中呈低表達(dá)，可能發(fā)揮抑癌基因作用，但在子宮內(nèi)膜癌中的研究較少。

本研究結(jié)果顯示，MFN2 在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)均低于非典型增生及正常子宮內(nèi)膜組織。MUSICCO 等[16]研究認(rèn)為，I型子宮內(nèi)膜癌組織中MFN2 蛋白表達(dá)低于正常內(nèi)膜組織及內(nèi)膜增生組織，在有線粒體突變的癌組織中降低更為顯著，這與本研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析子宮內(nèi)膜癌患者的臨床病理特征，結(jié)果表明MFN2 蛋白低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者的病理類型、分化程度、FIGO 分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；而與患者年齡、是否絕經(jīng)及肌層浸潤深度無關(guān)，提示MFN2 蛋白低表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展有重要關(guān)系。MITSUDOMI 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MFN2基因在人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞系中表達(dá)降低，而過表達(dá)MFN2 后可抑制MCF-7 細(xì)胞增殖。徐斌武等[18]研究證實(shí)，MFN2 蛋白在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)降低可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和腫瘤細(xì)胞干性特征，這些研究均提示MFN2基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起抑癌基因的作用，其低表達(dá)將促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。因此認(rèn)為，MFN2 蛋白在子宮內(nèi)膜癌中低表達(dá)，可能發(fā)揮抑癌基因作用，低表達(dá)可能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲。

Kaplan-Meier 法生存曲線結(jié)果顯示，本研究中MFN2 低表達(dá)子宮內(nèi)膜癌患者的中位生存期為23.5 個月，高表達(dá)患者的中位生存期為32.5 個月，MFN2 低表達(dá)患者的中位生存期低于高表達(dá)患者。SOARES等[19]應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測頭頸部黏膜黑色素瘤組織中MFN2 蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MFN2 蛋白在腫瘤組織中低表達(dá)，且與較低的無病生存期和總生存期有關(guān)。本研究結(jié)果與SOARES 等[19]的結(jié)果一致。因此，在今后的臨床治療中可通過檢測MFN2 蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)來作為對患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。

綜上所述，MFN2 的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的病理類型、FIGO 分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示兩者可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。因此，檢測兩者的相關(guān)性可對疾病的預(yù)后有提示作用，為子宮內(nèi)膜癌的診治提供新的思路和線索。