煙粉虱MED隱種BtβNAC基因克隆及表達(dá)分析

杜紅旭，王放放，劉旭，白潤娥

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

生物體內(nèi)新生蛋白多肽的合成受到嚴(yán)格調(diào)控，其中，新生多肽偶聯(lián)合體(Nascent polypeptide associated complex，NAC)是與核糖體緊密結(jié)合，防止新生多肽與細(xì)胞內(nèi)蛋白異常結(jié)合的功能蛋白復(fù)合體[1-4]。NAC屬于高豐度細(xì)胞質(zhì)蛋白，廣泛存在于哺乳動(dòng)物、酵母和植物細(xì)胞內(nèi)[5]。在生物體內(nèi)，NAC蛋白是由ɑ和β亞基構(gòu)成的異二聚體，兩類亞基均有各自的功能[6]。ɑ亞基具有轉(zhuǎn)錄激活活性，以及與DNA、rRNA和tRNA結(jié)合的活性；β亞基亦稱為即通用轉(zhuǎn)錄因子3(Btf3)，該亞基雖然缺乏轉(zhuǎn)錄激活的功能，但能與RNA聚合酶II相結(jié)合[5,7]。釀酒酵母的ɑ和β亞基均與新生蛋白多肽直接偶聯(lián)，但是只有β亞基與核糖體相結(jié)合[7]。現(xiàn)有研究表明，NAC蛋白β亞基的功能主要包括：(1)促進(jìn)核糖體與線粒體互作，確保延胡索酸酶和蘋果酸脫氫酶等線粒體蛋白保持正確的靶向[5]；(2)為轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的新生多肽提供保護(hù)性內(nèi)環(huán)境[8-10]；(3)與新生多肽互作，輔助其形成正確折疊，發(fā)揮分子伴侶功能[11-12]。在β-NAC蛋白缺失的秀麗線蟲體內(nèi)，編碼核蛋白、細(xì)胞溶質(zhì)蛋白和線粒體蛋白的mRNAs被錯(cuò)誤地靶向引導(dǎo)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，并且秀麗線蟲的平均壽命縮短了10 d[13]。此外，β亞基(BTF3)與哺乳動(dòng)物的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[14-16]；秀麗線蟲細(xì)胞凋亡抑制因子ICD(NAC蛋白β亞基)研究表明，過量表達(dá)ICD可以阻止細(xì)胞凋亡，RNAi干擾ICD的表達(dá)導(dǎo)致線蟲細(xì)胞的異常凋亡[17-19]；酵母β亞基參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和線粒體蛋白的輸出[11,20-21]。NAC蛋白的β亞基已在人類、哺乳動(dòng)物、酵母和秀麗線蟲，以及擬南芥[22-23]、煙草[24]、水稻[25]和小麥[26]等植物中有研究報(bào)道，尚未見到關(guān)于煙粉虱NAC蛋白的功能及其編碼基因的研究報(bào)道。本研究對(duì)煙粉虱MED隱種NAC蛋白β亞基編碼基因的序列和特征，以及該基因在煙粉虱不同發(fā)育階段和吡蟲啉脅迫條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，期望為進(jìn)一步研究昆蟲NAC蛋白的功能及化學(xué)防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與試劑

1.1.1 供試材料 煙粉虱MED隱種(寄主植物為煙草Nicotianatabacum)飼養(yǎng)于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院化學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑及儀器 pGM-T和pMAL-c2x載體質(zhì)粒為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院化學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1、Top Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒購置于TransGen Biotech(北京)公司；BL21感受態(tài)細(xì)胞、FastKing RT Kit (With gDNase) 購置于TIANGEN(北京)公司；總RNA提取試劑Trizol、PrimerSTAR Max購置于TaKaRa(大連)公司；限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI、SalI等購置于NEB(北京)公司；試驗(yàn)所用引物均自行設(shè)計(jì)，并由尚亞生物技術(shù)有限公司(鄭州)合成。

1.2 煙粉虱MED隱種NAC蛋白β亞基基因的克隆

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 用Trizol法提取健康煙粉虱成蟲的總RNA，后用FastKing RT Kit (With gDNase)試劑盒操作方法合成cDNA第一條鏈。

1.2.2 NAC蛋白β亞基基因克隆引物設(shè)計(jì) 根據(jù)螞蟻來源的NAC蛋白β亞基的氨基酸序列[27]，搜索GenBank的EST數(shù)據(jù)庫，預(yù)測拼接獲得一個(gè)包含完整開放讀碼框的煙粉虱NAC蛋白β亞基基因的cDNA序列并設(shè)計(jì)克隆引物(表1)。

表1 煙粉虱BtβNAC基因引物Table 1 Primers used for the isolation and expression of the BtβNAC gene in Bemisia tabaci MED

1.2.3 cDNA與基因組DNA克隆 以cDNA第一條鏈為模板，利用Prime STARMax DNA Polymerase(TaKaRa，大連)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得cDNA序列；以CTAB法提取的煙粉虱成蟲DNA為模板，進(jìn)行基因組DNA克隆，兩者克隆產(chǎn)物由尚亞生物技術(shù)有限公司(鄭州)完成測序驗(yàn)證后，提交NCBI GenBank獲得登錄號(hào)。

1.3 序列分析

利用SnapGene進(jìn)行序列分析，利用Clustal×1.83和Boxshade 軟件包對(duì)包括煙粉虱在內(nèi)的βNAC蛋白的氨基酸進(jìn)行序列聯(lián)配和聚類分析。

1.4 煙粉虱β亞基mRNA表達(dá)譜分析

1.4.1 材料處理及取樣 分別取處于不同發(fā)育期(卵、1齡、2齡、3齡、偽蛹和成蟲)的煙粉虱100頭，3次生物學(xué)重復(fù)，用液氮速凍后提取RNA。

1.4.2 藥劑吡蟲啉噴施處理 隨機(jī)選取發(fā)育良好一致的煙粉虱成蟲，接種于5葉期的煙草幼苗葉片，經(jīng)過24 h適應(yīng)生長后，噴施吡蟲啉(1 mg·L-1)，分別在0 、1/6 、1/2、1 、2 、4 、8 h取樣50頭，3次生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍后提取RNA。

1.4.3 定量分析 根據(jù)煙粉虱β亞基基因的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量引物NPf2/NPr2(表1)，以actin作為內(nèi)部參照(Af1/Ar1)。內(nèi)參基因actin的PCR擴(kuò)增條件與β亞基相同，除了退火溫度調(diào)整至62 ℃。3次重復(fù)。以非處理組相對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)量為對(duì)照，按照2-△△Ct方法分析目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量及其標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 煙粉虱NAC蛋白β亞基的原核表達(dá)

1.5.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建 用含有EcoR I和SalI酶切位點(diǎn)的引物NPf3/NPr3(表1)擴(kuò)增NAC蛋白β亞基基因，PCR產(chǎn)物純化回收連pGEM-T載體測序驗(yàn)證，同時(shí)用EcoRI和SalI酶切pGEM-T-βNAC與pMAL-c2x載體，分別回收目的片段和pMAL-c2x載體骨架用T4 DNA Ligase連接并轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，測序鑒定后將pMALc2x-BtβNAC成功重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)感受態(tài)E.coliBL21。

1.5.2 pMALc2x-BtβNAC的表達(dá)及聚丙烯酰胺凝膠分析 挑取含pMALc2x-BtβNAC質(zhì)粒的單克隆于5 mL LB液體培養(yǎng)基中(含50 mg·L-1Ampicillin)，37 ℃培養(yǎng)12 h后，在無菌工作臺(tái)中用移液器吸取過夜培養(yǎng)菌液500 μL，加入到50 mL含Ampicillin(50 mg·L-1)的新鮮LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600值達(dá)到0.5時(shí)添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG終濃度0.3 mmol·L-1)進(jìn)行誘導(dǎo)，收集誘導(dǎo)不同時(shí)期(0、0.5、1、3 h)菌液2 mL并提取誘導(dǎo)菌體總蛋白，用15%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱NAC蛋白β亞基基因克隆及序列分析

從煙粉虱成蟲來源mRNA克隆獲得1個(gè)與預(yù)期相符的特異性條帶(圖1)，經(jīng)測序結(jié)果分析確認(rèn)該序列為目的片段，命名為BtβNAC。具體序列分析結(jié)果顯示，BtβNAC基因全長856 bp，其中5’非翻譯區(qū)長度為134 bp，3’非翻譯區(qū)長度為272 bp，開放閱讀框編碼氨基酸149個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量約為16.16 kD，等電點(diǎn)約為8.97，屬于堿性蛋白。從煙粉虱基因組DNA中擴(kuò)增獲得BtβNAC基因的基因組片段(圖1)，測序結(jié)果證實(shí)該片段長度為4 430 bp，經(jīng)與cDNA序列比對(duì)分析顯示BtβNAC基因包含2外顯子和1內(nèi)顯子(圖2)，該序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)MK229180。

2.2 煙粉虱NAC蛋白β亞基結(jié)構(gòu)分析

利用生物信息學(xué)軟件(http://www.expasy.org/cgi-bin/prosite/)在線對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析結(jié)果顯示，該蛋白含有典型的NAC功能域(A32～L97)，表明該蛋白隸屬于NAC蛋白家族，C端缺少α亞基特有的UBA功能域，在N端含有β亞基特有的RRK-(X)2-KK基序(圖 2)，因此判定克隆所得基因?qū)儆贜AC蛋白β亞基。此外，該蛋白還存在3個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(3～5，20～22，31～34)和1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)(31～34)。

M:DL5000；1：煙粉虱BtβNAC gDNA；2：煙粉虱BtβNAC cDNA M:DL5000;1:cDNA of BtβNAC from Bemisia tabaci;2:Genomic DNA of of BtβNAC from Bemisia tabaci圖1 煙粉虱BtβNAC的cDNA、基因組DNA擴(kuò)增Fig.1 The result of amplification of cDNA and genomic DNA of BtβNAC from Bemisia tabaci

圖2 煙粉虱BtβNAC基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence of the BtβNAC gene from Bemisia tabaci and its deduced amino acid sequence

NAC功能域聚類分析顯示(圖3)，煙粉虱NAC蛋白β亞基與其他已知β亞基的氨基酸相似性介于28.9%～89.9%之間，與螞蟻Camponotusfloridanus(EFN63323)，印度跳蟻Harpegnathossaltator(EFN88288)，散白蟻Reticulitermesflavipes(AAP33157)和紅火蟻SolenopsisinvictaBuren(EFZ09605)相似性最高(89.9%)，與刺舌蠅Glossinamorsitansmorsitans(ADD19794)、大西洋鮭Salmosalar(ACI69109)、人Homosapiens(NP_001032726)、家鼠Housemouse(NP_663430)和非洲爪蟾Xenopuslaevis(NP_001088356)的相似性居中，分別為84.4%、80%、71.1%、71.1%和71.1%，而與釀酒酵母的相似性最低，分別為33.3%(EGD1，X78725)和28.9%(BTT1，X78724)。

圖3 已知部分NAC蛋白NAC domain分析黑色方框表示有100%的相似性，深灰色表示有50%的保守氨基酸Fig.3 Comparison of NAC domain sequences and dendrogram of ERF proteins Boxes in black represent 100% similarity,while dark grey indicates 50% conserved amino acids

2.3 煙粉虱β亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

NAC蛋白β亞基的轉(zhuǎn)錄表達(dá)對(duì)煙粉虱的生長發(fā)育關(guān)聯(lián)密切。從圖4可知，β亞基在煙粉虱MED隱種的各個(gè)生長階段均可檢測到表達(dá)，且不同生長階段表達(dá)量存在顯著差異。例如，與樣品卵中β亞基的表達(dá)量相比較，1齡、2齡和3齡若蟲，以及偽蛹和成蟲期體內(nèi)的表達(dá)量分別為卵的118.14、8.78、17.78、4.99、66.21倍，分析結(jié)果表明,β亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與煙粉虱生長發(fā)育密切相關(guān)。

以卵中表達(dá)量作為1，選取actin作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。1：卵；2：1齡若蟲；3：2齡若蟲；4：3齡若蟲；5：偽蛹；6：成蟲。The relative expression level of BtβNAC in different developmental stages of Bemisia tabaci MED is determined by 2-△△Ct method compared with that in the eggs,and the actin is selected as the housekeeping gene.Data in the figue are mean±SE. 1：eggs；2：1st instar；3：2nd instar；4：3rd instar；5：Pupa；6：adult.圖4 煙粉虱BtβNAC不同發(fā)育時(shí)期相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression level of BtβNAC in different developmental stages of Bemisia tabaci

2.4 煙粉虱β亞基的表達(dá)受吡蟲啉脅迫誘導(dǎo)

在噴施1 mg·L-1吡蟲啉脅迫條件下，煙粉虱MED隱種成蟲體內(nèi)NAC蛋白β亞基的表達(dá)量總體受到抑制，并呈現(xiàn)多峰曲線變化趨勢(圖5)。處理10 min時(shí)β亞基的表達(dá)量迅速降至對(duì)照的49.67%，處理30 min時(shí)該基因的表達(dá)量短暫回升至對(duì)照的92.63%，但隨著脅迫時(shí)間的延長該基因表達(dá)量又迅速下降，如處理1 h和2 h時(shí)的表達(dá)量分別為對(duì)照的35.32%和52.39%，在脅迫4 h表達(dá)量回升至峰值的110.01%，此后表達(dá)量迅速回落，處理6 h和8 h時(shí)的表達(dá)量分別為對(duì)照的34.88%和67.37%。

圖5 吡蟲啉處理?xiàng)l件下煙粉虱成蟲體內(nèi)β-NAC的相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of β-NAC of Bemisia tabaci adult under imidacloprid stress

2.5 β亞基融合蛋白體外表達(dá)

在構(gòu)建完成測序證實(shí)重組表達(dá)載體pMALc2x-BtβNAC正確之后，利用大腸桿菌菌株BL21對(duì)pMALc2x::BtβNAC融合蛋白進(jìn)行體外表達(dá)，分別提取各樣品總蛋白，采用SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳檢測。檢測結(jié)果顯示(圖6)，在異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(0.3 mmol·L-1)誘導(dǎo)下，重組載體pMALc2x-BtβNAC菌體總蛋白樣品中可檢測到分子量約為58.8 kD的特異性蛋白條帶，與預(yù)期pMALc2x::BtβNAC融合蛋白分子量大小相符；該結(jié)果證實(shí)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可強(qiáng)烈誘導(dǎo)pMALc2x::BtβNAC融合蛋白的表達(dá)，如誘導(dǎo)0.5 h時(shí)表達(dá)量即達(dá)到峰值(泳道3)，延長誘導(dǎo)時(shí)間并不能增加表達(dá)量，例如誘導(dǎo)1 h(泳道4)，3 h(泳道5)后的表達(dá)量未見增加，反而略有下降趨勢；融合蛋白pMALc2x::BtβNAC同時(shí)存在于上清液和沉淀中，且沉淀中的含量略高于上清液。

1:蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物；2 to 5:分別為IPTG誘導(dǎo)0、0.5、1、3 h 樣品總蛋白；6:超聲波破碎后上清液總蛋白；7:超聲波破碎后沉淀總蛋白。1:Protein molecular weight marker;2 to 5:Ttotal protein from cells induced by IPTG for 0,0.5,1,3 h,respectively;6:Ttotal protein from the supernatant；7:Ttotal protein from the pellet.圖6 煙粉虱β-NAC體外表達(dá)SDS-PAGE電泳檢測Fig.6 Expression of β-NAC of Bemisia tabaci in vitro detected by SDS-PAGE

3 討論

存在于在真核生物的異源二聚體型NAC蛋白均由α和β亞基構(gòu)成[28]，雖然兩者間氨基酸序列相似性只有26%左右，但是均含有高度保守的NAC功能域[29]，本研究的煙粉虱BtβNAC同樣也具有1個(gè)由66個(gè)氨基酸構(gòu)成的NAC功能域，并且與其他動(dòng)物來源的β亞基的NAC功能域相似性介于71.1%～89.9%，然而與釀酒酵母的EGD1和BTT1相似性只有33.3%和28.9%，表明NAC功能域的分化處于物種進(jìn)化的早期階段。與其他物種來源β亞基缺少UBA功能域類似，BtβNAC同樣不含該功能域，而是在N端含有RRK-(X)2-KK基序，表明β亞基在物種間具有高度的一致性。

對(duì)于生物體來說及時(shí)表達(dá)正確折疊和定位的功能蛋白質(zhì)至關(guān)重要[30]，生物體細(xì)胞內(nèi)已開發(fā)出多種啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和監(jiān)控重要蛋白合成及成熟的調(diào)控機(jī)制，包括蛋白質(zhì)的N端加工、膜定位，以及新生肽的折疊等[31]。已有研究表明，NAC蛋白基因在生物體內(nèi)的不同組織中均能表達(dá)，但表達(dá)水平的差異與發(fā)育程度密切相關(guān)[32]，這可能是由于NAC通過與合成至核糖體的新生肽直接結(jié)合參與新生肽的早期折疊有關(guān)。本研究結(jié)果同樣證實(shí)BtβNAC在煙粉虱的各發(fā)育階段均表達(dá)，尤其在1齡若蟲和成蟲階段表達(dá)量較高，顯著高于卵、2齡、3齡和偽蛹。吡蟲啉作為一種內(nèi)吸性殺蟲劑，通過競爭性結(jié)合煙酸乙酰膽堿酯酶受體干擾昆蟲體內(nèi)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的化學(xué)信號(hào)傳遞，使其麻痹死亡。本研究結(jié)果顯示，在噴施低濃度吡蟲啉條件下，煙粉虱成蟲內(nèi)體BtβNAC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)呈抑制下調(diào)模式，這可能是在吡蟲啉處理?xiàng)l件下煙粉虱體內(nèi)的新陳代謝下降，新生蛋白合成表達(dá)量降低，對(duì)于主要作為新生肽分子伴侶功能的BtβNAC需求量降低所致。本研究過程構(gòu)建的原核表達(dá)載體pMALc2x-BtβNAC，其融合蛋白pMALc2x::BtβNAC在宿主菌BL21中高效穩(wěn)定表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物同時(shí)以可溶性蛋白和沉淀形式存在，這為后續(xù)純化BtβNAC蛋白，制備抗體等奠定了基礎(chǔ)。