白藜蘆醇對(duì)H9C2心肌細(xì)胞Kv2.1鉀通道的影響*

黃曉燕

白藜蘆醇是天然植物中提取的一種非黃酮類多酚化合物,具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡、抗腫瘤等藥理作用[1－2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明白藜蘆醇具有抗心律失常作用[3]。Kv2.1 是電壓門控性鉀離子通道(voltage-gated potassium channels,Kv)的成員之一[4],廣泛表達(dá)于神經(jīng)元和嚙齒類動(dòng)物心肌細(xì)胞,是心肌動(dòng)作電位3相復(fù)極的主要離子流延遲整流鉀電流(delayed rectifier K＋current,IK)的主要分子基礎(chǔ)。筆者研究白藜蘆醇對(duì)H9C2大鼠心肌細(xì)胞Kv2.1鉀通道的影響,進(jìn)一步探討其抗心律失常的離子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific 公司;胎牛血清購(gòu)自Gibco公司;兔抗Kv2.1 多克隆抗體購(gòu)自Abbkine公司;膜片鉗系統(tǒng)及分析軟件為美國(guó)Axon公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)藥物白藜蘆醇購(gòu)自Sigma公司,配成10 mmol/L母液。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 H9C2 大鼠心肌細(xì)胞購(gòu)買自中科院上海細(xì)胞庫(kù),常規(guī)用含10%FBS DMEM 培養(yǎng)基,放置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分實(shí)驗(yàn)組(白藜蘆醇干預(yù))和對(duì)照組(未加入白藜蘆醇)。

1.3 Kv2.1 鉀通道電流的研究 室溫下(24～26℃)采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察Kv2.1電流。電極外液配方(mmol/L):NaCl 60、Na-gluconate 80、CaCl20.1、MgCl21、KCl 5、HEPES 10、glucose 10(用NaOH 將p H 調(diào) 至7.4)。電 極 內(nèi) 液 配 方(mmol/L):MgCl20.5、KCl 30、K-gluconate 110、EGTA 10、HEPES 5、Na2ATP 5、GTP-tris 1(用KOH 將p H 調(diào)至7.2)。灌注電極內(nèi)液后電極入水電阻為3～5 mΩ;刺激程序由Clampex 9.2 軟件和Axon 700B 放大器共同完成,信號(hào)經(jīng)過(guò)Axon 700B放大器和A/D 轉(zhuǎn)換后儲(chǔ)存于計(jì)算機(jī)中。

1.4 Kv2.1鉀通道蛋白表達(dá)的檢測(cè) 收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞,加入預(yù)冷RIPA 細(xì)胞裂解液。取細(xì)胞裂解上清液20μl,點(diǎn)樣于8%SDS-PAGE,電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。兔抗Kv2.1多克隆抗體1∶500 稀釋,4 ℃孵育過(guò)夜。二抗采用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體,1∶1 000 稀釋,室溫孵育2 h,最后在化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中觀察拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用pCLAMP Ver.9.2 軟件(Axon Instruments,California,USA)編輯刺激程序、記錄電流及分析和測(cè)量原始數(shù)據(jù)。Excel和Origin7.5 軟件對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、擬合和作圖。將采集到的原始數(shù)據(jù)除以膜電容,得到電流密度值,相對(duì)各激活電壓,采用Origin7.5 軟件作圖,得到電流密度-電壓圖。藥物的半數(shù)最大效應(yīng)濃度(EC50)用Hill方程E＝Emax/[1＋(EC50/C)n]進(jìn)行擬合。通道的激活電流通過(guò)單指數(shù)方程擬合,得到不同去極化電壓下的激活時(shí)間常數(shù)。穩(wěn)態(tài)失活電流經(jīng)最大電流標(biāo)準(zhǔn)化,用Boltzmann 方程I/Imax ＝1－ {1＋exp[(Vt－V1/2)/k]}－1擬合,得到穩(wěn)態(tài)失活擬合圖(Imax為最大通道電流,Vt為測(cè)試電壓,V1/2為半失活最大電壓,k 為斜率因子),以V1/2和k 評(píng)價(jià)藥物對(duì)失活過(guò)程的影響。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用藥前后比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)Kv2.1通道電流的作用 為評(píng)價(jià)白藜蘆醇對(duì)Kv2.1通道電流的時(shí)間依賴性和濃度依賴性,采用以下刺激方案:細(xì)胞鉗制在－60 m V,測(cè)試電壓＋40 m V 并持續(xù)300 ms,然后去極化到－40 m V 持續(xù)100 ms。白藜蘆醇分別干預(yù)H9C2細(xì)胞12、24、48h,圖1A 顯示:與對(duì)照組相比,白藜蘆醇能夠明顯增強(qiáng)Kv2.1 通道電流,具有時(shí)間依賴性。1、5、20、100μmol/L 白藜蘆醇分別干預(yù)24 h,以藥物濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),相對(duì)電流密度為縱坐標(biāo),得到濃度效應(yīng)曲線,用Hill方程進(jìn)行擬合。濃度效應(yīng)關(guān)系見(jiàn)圖1B,EC50為14.02μmol/L。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用20μmol/L 白藜蘆醇干預(yù)H9C2細(xì)胞24 h作為實(shí)驗(yàn)組。

2.2 兩組Kv2.1通道電流密度的比較 記錄激活電流刺激方案為:細(xì)胞鉗制在－60m V,測(cè)試電壓從－70 m V,以10 m V 的階躍,刺激到＋50 m V,持續(xù)300 ms;然后去極化到－40 m V,持續(xù)100 ms。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組Kv2.1通道電流曲線圖(圖2A、B),電流密度-電壓圖(圖2C),可以看到白藜蘆醇能夠明顯增強(qiáng)Kv2.1 通道電流,具有電壓依賴性。結(jié)果顯示,＋50 m V 處,白藜蘆醇干預(yù)前后電流密度分別為(34.86±7.71)p A/p F 和(60.82±1.68)p A/p F,增加了74.5%(n＝6,P＜0.05)。

圖2 兩組Kv2.1通道電流曲線圖和電流密度的比較

2.3 白藜蘆醇對(duì)Kv2.1通道電流激活特性的影響 對(duì)圖2的Kv2.1通道電流曲線圖,通過(guò)單指數(shù)方程擬合得到激活時(shí)間常數(shù)。從圖3 可以看到,對(duì)照組的激活時(shí)間常數(shù)在＋10 m V 處為(21.82±1.40)ms,而在＋50 m V 處變?yōu)?4.19±0.38)ms,實(shí)驗(yàn)組通道＋50 m V 處的激活時(shí)間常數(shù)由(4.19±0.38)ms變?yōu)?2.70±0.22)ms?？梢?jiàn)Kv2.1 通道激活的時(shí)間進(jìn)程具有電壓依賴性,白藜蘆醇加速了Kv2.1通道的激活進(jìn)程。

圖3 兩組Kv2.1通道電流激活特性的比較

2.4 白藜蘆醇對(duì)Kv2.1電流失活特性的影響 細(xì)胞鉗制在－80 m V,測(cè)試電壓以10 m V 階躍從－100 m V 刺激到30 m V,持續(xù)時(shí)間6 s;然后測(cè)試電壓鉗制在40 m V 時(shí)記錄電流(見(jiàn)圖4)。兩組穩(wěn)態(tài)失活電流曲線圖見(jiàn)圖4A、B,圖4C為穩(wěn)態(tài)失活電流經(jīng)最大電流標(biāo)準(zhǔn)化,用Boltzmann 方程擬合,得到穩(wěn)態(tài)失活擬合圖,從而求出V1/2和k。結(jié)果顯示,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組半失活最大電壓V1/2分別為(－28.60±2.23)m V 和(－13.34±1.15)m V(n＝6,P＜0.05),k 值分別為(11.68±2.06)m V 和(9.72±1.00)m V(n＝6,P＞0.05)。可見(jiàn)白藜蘆醇減慢了Kv2.1通道的失活過(guò)程,且白藜蘆醇導(dǎo)致Kv2.1通道的失活曲線右移了15.26 m V,但是k 值卻沒(méi)有明顯變化。

2.5 兩組Kv2.1鉀通道蛋白表達(dá)的比較 與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組Kv2.1 通道蛋白條帶增強(qiáng),并且實(shí)驗(yàn)組目的條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶的相對(duì)比值明顯高于對(duì)照組(P＜0.05,圖5)。

3 討論

有研究報(bào)道,白藜蘆醇能夠通過(guò)增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的高電導(dǎo)鈣敏感性鉀通道的活動(dòng),使細(xì)胞膜去極化,導(dǎo)致鈣通道失活降低細(xì)胞內(nèi)游離鈣,進(jìn)而舒張血管[5]。有研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇與格列本脲聯(lián)合應(yīng)用,通過(guò)恢復(fù)kir6.2亞基蛋白表達(dá)和鉀離子通道,從而減輕糖尿病大鼠缺血再灌注誘發(fā)的心律失常[3]。本研究首先證實(shí)白藜蘆醇對(duì)Kv2.1通道電流具有增強(qiáng)作用,呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性,其EC50為14.02μmol/L。白藜蘆醇對(duì)Kv2.1電流的增強(qiáng)作用還具有電壓依賴性,＋50 m V 處Kv2.1通道電流密度比干預(yù)前增加了74.5%,可見(jiàn)白藜蘆醇能夠正向調(diào)控Kv2.1通道電流。在獲得性長(zhǎng)QT 綜合征動(dòng)物模型中,白藜蘆醇通過(guò)顯著降低動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間、QT 間期和復(fù)極離散度,從而發(fā)揮良好的抗心律失常作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相符合。

圖4 兩組Kv2.1通道電流失活特性的比較

圖5 兩組Kv2.1鉀通道蛋白條帶

Kv通道的重要特性之一就是電壓敏感性,可被膜電位去極化而激活。本研究表明,隨著細(xì)胞膜去極化程度的增加,Kv2.1 通道的激活加 快,Kv2.1 通道激活時(shí)間常數(shù)具有電壓依賴性,并且白藜蘆醇減少了Kv2.1 通道的激活時(shí)間常數(shù),加快了該通道的激活過(guò)程。Kv2.1 通道是失活相對(duì)較慢的一種鉀離子通道。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)測(cè)試電壓小于－80 m V 時(shí),Kv2.1 通道基本沒(méi)有失活,從－80 m V 開(kāi)始Kv2.1通道逐漸失活,當(dāng)電壓大于＋20 m V 時(shí),該通道基本失活。白藜蘆醇干預(yù)后使得Kv2.1 通道的失活曲線右移了15.26 m V,這將導(dǎo)致由Kv2.1介導(dǎo)的延遲整流鉀電流在動(dòng)作電位復(fù)極化階段滅活減慢,縮短心肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程,增強(qiáng)其興奮性。

本研究還發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能促進(jìn)Kv2.1 通道蛋白表達(dá),可見(jiàn)白藜蘆醇可能主要通過(guò)上調(diào)蛋白表達(dá),影響Kv2.1通道進(jìn)而改變電流,一定程度上揭示白藜蘆醇抗心律失常的作用機(jī)制。