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    抑制曲霉菌的乳酸菌分離及鑒定

    2020-10-30 01:54:02李利紅劉海榮賀瑩
    安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2020年16期

    李利紅 劉海榮 賀瑩

    摘要:以蘿卜、酸黃瓜和泡椒3種市售腌制醬菜為試驗(yàn)材料,采用溶鈣圈法分離純化疑似乳酸菌,采用革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶和雙層平板等方法篩選抑菌性菌株,采用生化鑒定和糖發(fā)酵鑒定其種屬。結(jié)果表明:從3份醬菜樣品中分離到40株疑似乳酸菌,篩選出3株(S1、S6、P5)對(duì)黑曲霉菌具有抑制性,2株(S6、S7)對(duì)黃曲霉具有抑制性,發(fā)現(xiàn)菌株S1、S7為發(fā)酵乳桿菌,菌株S6、P3為植物乳桿菌。

    關(guān)鍵詞:乳酸菌;曲霉菌;抑菌;分離鑒定

    中圖分類(lèi)號(hào) S816.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731 (2020) 16-0040-03

    霉菌是一種能形成分枝菌絲的真菌,是對(duì)一類(lèi)絲狀真菌的統(tǒng)稱(chēng)。黃曲霉素是一種致癌物,致癌力居首位,是目前已知最強(qiáng)致癌物之一,在食品中污染非常廣泛[1]。黑曲霉可以分泌葡萄糖苷酶等蛋白,也可吸附重金屬離子,對(duì)動(dòng)物腎臟造成不可逆的致死毒害,并可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)甚至死亡[2]。有研究表明,乳酸菌有抑制雜菌作用,但是從發(fā)酵型食品中篩選具有抑菌菌株的研究較少。乳制品中常見(jiàn)的菌種有保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌[3-4],而發(fā)酵類(lèi)蔬菜中常見(jiàn)的菌種有植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等[5]。每天攝入定量的活菌乳酸菌,可有效地預(yù)防和緩解微量元素引發(fā)疾病。更為重要的是,乳酸菌為兼性厭氧菌,缺氧環(huán)境利于其快速生長(zhǎng),間接對(duì)致病雜囷形成抑制,有效控制腸道內(nèi)菌種,減少有害菌引發(fā)疾病[6-7]。目前,化學(xué)防腐劑的應(yīng)用有效地控制了腐敗變質(zhì),但化學(xué)防腐劑具有副作用,如致癌等,國(guó)家對(duì)有害食品添加劑發(fā)布禁令,限制或限量使用。因此,篩選廣譜高抑菌活性的乳酸菌,且應(yīng)用于食品的生產(chǎn)及保存,具有重要的實(shí)踐意義[8-9]。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 分離樣品 市售腌制醬菜酸黃瓜、蘿卜、泡椒。

    1.1.2 指示菌 標(biāo)準(zhǔn)霉菌:黑曲霉ATCC16404(上海魯微科技有限公司);黃曲霉AS3.3950(上海魯微科技有限公司)。

    1.1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)室自配[10-11]。

    1.1.4 主要試劑 革蘭氏染色液:上海海博生物;對(duì)二甲氨基甲醛:天津致遠(yuǎn)試劑有限公司;明膠:上海制成化學(xué)試劑有限公司;30%過(guò)氧化氫:天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

    1.1.5 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋(LDZX-50KBS):上海申安醫(yī)療器械廠;超凈工作臺(tái)(ZHJHC1112B):上海智城分析儀器制造公司;恒溫培養(yǎng)箱(SPX-250):上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;生物顯微鏡(SMART):重慶奧特;渦旋振蕩器(MS3 basic): IKA;電子天平(CPA225D):賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱(BGI-146):上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;紫外分光光度計(jì)(UV-31OOPC):上海美普達(dá)儀器有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 乳酸菌分離 乳酸菌富集:在超凈工作臺(tái)中,用無(wú)菌操作方法,取少量醬菜樣品于MRS液體培養(yǎng)基,37℃恒溫厭氧(放入干燥器中,點(diǎn)燃酒精燈后密閉)培養(yǎng)24h。梯度稀釋?zhuān)簩⑴囵B(yǎng)液充分震蕩,取培養(yǎng)液1 mL,加入含9mL無(wú)菌水的干凈試管中,則濃度為10-1;充分振蕩混勻后,再?gòu)?0-1稀釋液中取1mL加入另一支含9mL無(wú)菌水干凈試管中,則濃度為10-2;依此類(lèi)推稀釋到10-6,應(yīng)注意無(wú)菌操作,試管和移液槍槍頭都應(yīng)滅菌,且每次更換移液槍槍頭。乳酸菌分離:將含3%CaC03的MRS瓊脂培養(yǎng)基滅菌冷卻至50℃,傾倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿15mL,待其凝固后,吸取稀釋液10-3、10-4、10-5、10-6各0.1 mL于培養(yǎng)基中,涂布均勻,37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h,待其長(zhǎng)出菌苔后觀察,平板菌落數(shù)20~20()[12]。

    1.2.2 乳酸菌初步鑒定

    1.2.2.1 革蘭氏染色鑒定 參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

    1.2.2.2 過(guò)氧化氫酶活性鑒定 用接種環(huán)挑取一環(huán)革蘭氏染色為陽(yáng)性(紫色)的菌落到干凈載玻片,滴加一滴3 %過(guò)氧化氫,產(chǎn)生氣泡為陽(yáng)性,不產(chǎn)生為陰性。過(guò)氧化氫酶陰性菌落可初步確定為乳酸菌。

    1.2.3 分離菌落純化 將初步鑒定為乳酸菌的菌株,在MRS瓊脂培養(yǎng)基反復(fù)劃線,得到單個(gè)菌落,轉(zhuǎn)接至試管斜面,4℃冷藏保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[14]。

    1.2.4 抑制霉菌活性的乳酸菌篩選

    1.2.4.1 霉菌孢子液制備 取冷藏保存菌種,PDA試管斜面劃線活化,28℃恒溫培養(yǎng)5d,至大量孢子產(chǎn)生,向試管中加入5mL無(wú)菌水,用接種環(huán)輕輕刮取,充分振蕩,經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲殘?bào)w后倒出。取1mL孢子懸浮液,10倍濃度梯度稀釋?zhuān)?0-2、10-3、10-4各0.1 mL涂布于PDA平板,28℃恒溫培養(yǎng)2d,察生長(zhǎng)密度,菌落數(shù)適宜濃度30~300。

    1.2.4.2 抑菌菌株篩選 雙層平辦法:倒入MRS瓊脂培養(yǎng)基作為下層平板,將分離得到的乳酸菌在MRS平板劃2條長(zhǎng)2cm的平行直線,37℃恒溫培養(yǎng)24h,至長(zhǎng)出菌苔,再倒入含有霉菌孢子的PDA瓊脂培養(yǎng)基作為上層平板,28℃恒溫培養(yǎng)2d,以接種霉菌孢子但不接種乳酸菌為空白對(duì)照,觀察霉菌生長(zhǎng)面積,測(cè)量計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式如下:

    抑菌率(%)=(S-SM1)/(S-SM0)×100 (1)

    式中:S為平板總面積,cm2;SM1為試驗(yàn)組霉菌生長(zhǎng)面積,cm2; SM0為對(duì)照組霉菌生長(zhǎng)面積,cm2。

    1.2.5 抑菌乳酸菌理化鑒定

    1.2.5.1 明膠液化試驗(yàn) 將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后,按照1%的接種量接種于明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,每個(gè)菌株接10支試管,每支以不接種的試管為空白對(duì)照。在37℃恒溫厭氧培養(yǎng),每隔2d分別取2支試管和空白組進(jìn)行觀察。先將試管置于冰箱冷凍至空白組凝固,若空白組培養(yǎng)基凝固而試驗(yàn)組培養(yǎng)基不凝同,則為明膠液化陽(yáng)性,否則為陰性。

    1.2.5.2 產(chǎn)生試驗(yàn) 將濾紙剪成約0.5~0.6cm寬的紙條,長(zhǎng)度根據(jù)試管而定,用80g/L乙酸鉛溶液浸潤(rùn),烘干。將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后,按照1%的接種量接種于硫化氫培養(yǎng)基中,鑷子子夾取1 一條乙酸鉛紙條,懸掛于接種試管內(nèi),下端靠近培養(yǎng)液,以上部分不接觸,用棉塞塞緊,37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h,在不接種的試管內(nèi)懸掛紙條作為空白對(duì)照。觀察紙條是否有黑色物質(zhì)產(chǎn)生,若有為陽(yáng)性,否則為陰性。

    1.2.5.3 吲哚試驗(yàn) 將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后,按照1%的接種量接種于H2S液體培養(yǎng)基中,并設(shè)置空白對(duì)照。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)4d后,沿管壁緩慢加入吲哚試劑數(shù)滴,觀察分界處若有紅色產(chǎn)生,則為陽(yáng)性,否則為陰性。

    1.2.5.4 淀粉水解試驗(yàn) 將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后,用無(wú)菌生理鹽水稀釋105倍,吸取0.1 mL涂布于淀粉培養(yǎng)基上,并設(shè)空白對(duì)照。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)2d長(zhǎng)出菌苔后,向平板上滴加碘液,觀察顏色變化。若空白組明顯變藍(lán),而試驗(yàn)組無(wú)明顯顏色變化,則為淀粉水解酶陽(yáng)性,否則為陰性。

    1.2.5.5 V-P試驗(yàn)(乙酰甲基甲醇試驗(yàn))將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后,按照1%的接種量接種于V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基中,并設(shè)空白對(duì)照。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h后,取2mL培養(yǎng)液加入等體積的40%氫氧化鈉溶液混勻,再加入1mg肌酸,充分振蕩后靜置30~60min,觀察顏色變化,若顏色變紅,則為陽(yáng)性,否則為陰性。

    1.2.5.6 乳酸菌碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn) 將斜面保存的乳酸菌菌種接種至MRS液體培養(yǎng)基,2次傳代培養(yǎng)后,去0.05mL培養(yǎng)液接種至碳水化合物發(fā)酵培養(yǎng)基,37℃恒溫厭氧培養(yǎng)(表1)。結(jié)果判定:陽(yáng)性結(jié)果為培養(yǎng)基中的顏色變黃;弱陽(yáng)性結(jié)果為培養(yǎng)基的顏色部分變黃;陰性結(jié)果為顏色不變,與不含糖類(lèi)的對(duì)照管相同。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 乳酸菌分離結(jié)果 根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況,稀釋濃度為10-5,選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。菌落為乳白色,表面光滑,呈圓形,酸黃瓜和泡椒中菌株為桿狀,蘿卜中菌株為球狀。3種樣品中的菌落,蘿卜中菌株沒(méi)有溶鈣圈,泡椒中有20株,酸黃瓜中有25株。對(duì)具溶鈣圈菌株進(jìn)行革蘭氏染色,結(jié)果共有40株G+、5株G-。再對(duì)40株G+菌株進(jìn)行接觸酶試驗(yàn),結(jié)果都為陰性,可初步確定為乳酸菌,分別編號(hào)為P1~16,S1~24,轉(zhuǎn)接至試管斜面保存。

    2.2 菌株篩選結(jié)果 通過(guò)觀察涂布霉菌孢子的平板菌落數(shù),霉菌孢子懸浮液1 mL稀釋100倍,涂布0.1 mL菌落數(shù)較為合適。通過(guò)雙層平辦法,結(jié)果顯示共有3株菌株(S1,S6, P5)對(duì)黑曲霉菌抑制效果較顯著,2株菌株(S6,S7)對(duì)黃曲霉抑制作用較顯著,S1對(duì)黑曲霉抑菌率為26%,S6對(duì)黑曲霉抑菌率為36%,P5對(duì)黑曲霉抑菌率為28%,S6對(duì)黃曲霉抑菌率為24%,S7對(duì)黃曲霉抑菌率為23%。

    2.3 生理生化鑒定結(jié)果 由表2和表3可知,根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定,菌株S1、S7為發(fā)酵乳桿菌,S6、P3為植物乳桿菌。

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)以3份市售醬菜為材料,分離得到45株疑似乳酸菌;經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定,其中40株菌株初步確定為乳酸菌;以黑曲霉菌和黃曲霉菌為指示菌,采用雙層平辦法篩選出4株具有抑制霉菌活性菌株;通過(guò)生理生化鑒定和糖發(fā)酵試驗(yàn),鑒定菌株分別為發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌。

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    (責(zé)編:張宏民)

    基金項(xiàng)目:山西省高等學(xué)??萍紕?chuàng)新項(xiàng)目(2019L0980);山西省高等學(xué)校教學(xué)改革創(chuàng)新項(xiàng)目(J2016114);呂梁學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目。

    作者簡(jiǎn)介:李利紅(1984-),女,山西臨縣人,研究方向:微生物生理。 *通訊作者

    收稿日期:2020-06-30

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