抑制曲霉菌的乳酸菌分離及鑒定

李利紅 劉海榮 賀瑩

摘要：以蘿卜、酸黃瓜和泡椒3種市售腌制醬菜為試驗(yàn)材料，采用溶鈣圈法分離純化疑似乳酸菌，采用革蘭氏染色、過(guò)氧化氫酶和雙層平板等方法篩選抑菌性菌株，采用生化鑒定和糖發(fā)酵鑒定其種屬。結(jié)果表明：從3份醬菜樣品中分離到40株疑似乳酸菌，篩選出3株（S1、S6、P5）對(duì)黑曲霉菌具有抑制性，2株（S6、S7）對(duì)黃曲霉具有抑制性，發(fā)現(xiàn)菌株S1、S7為發(fā)酵乳桿菌，菌株S6、P3為植物乳桿菌。

關(guān)鍵詞：乳酸菌;曲霉菌;抑菌;分離鑒定

中圖分類(lèi)號(hào) S816.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731 （2020） 16-0040-03

霉菌是一種能形成分枝菌絲的真菌，是對(duì)一類(lèi)絲狀真菌的統(tǒng)稱(chēng)。黃曲霉素是一種致癌物，致癌力居首位，是目前已知最強(qiáng)致癌物之一，在食品中污染非常廣泛[1]。黑曲霉可以分泌葡萄糖苷酶等蛋白，也可吸附重金屬離子，對(duì)動(dòng)物腎臟造成不可逆的致死毒害，并可導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)甚至死亡[2]。有研究表明，乳酸菌有抑制雜菌作用，但是從發(fā)酵型食品中篩選具有抑菌菌株的研究較少。乳制品中常見(jiàn)的菌種有保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌[3-4]，而發(fā)酵類(lèi)蔬菜中常見(jiàn)的菌種有植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌等[5]。每天攝入定量的活菌乳酸菌，可有效地預(yù)防和緩解微量元素引發(fā)疾病。更為重要的是，乳酸菌為兼性厭氧菌，缺氧環(huán)境利于其快速生長(zhǎng)，間接對(duì)致病雜囷形成抑制，有效控制腸道內(nèi)菌種，減少有害菌引發(fā)疾病[6-7]。目前，化學(xué)防腐劑的應(yīng)用有效地控制了腐敗變質(zhì)，但化學(xué)防腐劑具有副作用，如致癌等，國(guó)家對(duì)有害食品添加劑發(fā)布禁令，限制或限量使用。因此，篩選廣譜高抑菌活性的乳酸菌，且應(yīng)用于食品的生產(chǎn)及保存，具有重要的實(shí)踐意義[8-9]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 分離樣品 市售腌制醬菜酸黃瓜、蘿卜、泡椒。

1.1.2 指示菌 標(biāo)準(zhǔn)霉菌：黑曲霉ATCC16404（上海魯微科技有限公司）;黃曲霉AS3.3950（上海魯微科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室自配[10-11]。

1.1.4 主要試劑 革蘭氏染色液：上海海博生物;對(duì)二甲氨基甲醛：天津致遠(yuǎn)試劑有限公司;明膠：上海制成化學(xué)試劑有限公司;30%過(guò)氧化氫：天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.1.5 主要儀器 高壓蒸汽滅菌鍋（LDZX-50KBS）：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);超凈工作臺(tái)（ZHJHC1112B）：上海智城分析儀器制造公司;恒溫培養(yǎng)箱（SPX-250）：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司;生物顯微鏡（SMART）：重慶奧特;渦旋振蕩器（MS3 basic）： IKA;電子天平（CPA225D）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;電熱鼓風(fēng)干燥箱（BGI-146）：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;紫外分光光度計(jì)（UV-31OOPC）：上海美普達(dá)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌分離 乳酸菌富集：在超凈工作臺(tái)中，用無(wú)菌操作方法，取少量醬菜樣品于MRS液體培養(yǎng)基，37℃恒溫厭氧（放入干燥器中，點(diǎn)燃酒精燈后密閉）培養(yǎng)24h。梯度稀釋?zhuān)簩⑴囵B(yǎng)液充分震蕩，取培養(yǎng)液1 mL，加入含9mL無(wú)菌水的干凈試管中，則濃度為10-1;充分振蕩混勻后，再?gòu)?0-1稀釋液中取1mL加入另一支含9mL無(wú)菌水干凈試管中，則濃度為10-2;依此類(lèi)推稀釋到10-6，應(yīng)注意無(wú)菌操作，試管和移液槍槍頭都應(yīng)滅菌，且每次更換移液槍槍頭。乳酸菌分離：將含3%CaC03的MRS瓊脂培養(yǎng)基滅菌冷卻至50℃，傾倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿15mL，待其凝固后，吸取稀釋液10-3、10-4、10-5、10-6各0.1 mL于培養(yǎng)基中，涂布均勻，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h，待其長(zhǎng)出菌苔后觀(guān)察，平板菌落數(shù)20～20（）[12]。

1.2.2 乳酸菌初步鑒定

1.2.2.1 革蘭氏染色鑒定 參見(jiàn)文獻(xiàn)[13]。

1.2.2.2 過(guò)氧化氫酶活性鑒定 用接種環(huán)挑取一環(huán)革蘭氏染色為陽(yáng)性（紫色）的菌落到干凈載玻片，滴加一滴3 %過(guò)氧化氫，產(chǎn)生氣泡為陽(yáng)性，不產(chǎn)生為陰性。過(guò)氧化氫酶陰性菌落可初步確定為乳酸菌。

1.2.3 分離菌落純化 將初步鑒定為乳酸菌的菌株，在MRS瓊脂培養(yǎng)基反復(fù)劃線(xiàn)，得到單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接至試管斜面，4℃冷藏保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[14]。

1.2.4 抑制霉菌活性的乳酸菌篩選

1.2.4.1 霉菌孢子液制備 取冷藏保存菌種，PDA試管斜面劃線(xiàn)活化，28℃恒溫培養(yǎng)5d，至大量孢子產(chǎn)生，向試管中加入5mL無(wú)菌水，用接種環(huán)輕輕刮取，充分振蕩，經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾菌絲殘?bào)w后倒出。取1mL孢子懸浮液，10倍濃度梯度稀釋?zhuān)?0-2、10-3、10-4各0.1 mL涂布于PDA平板，28℃恒溫培養(yǎng)2d，察生長(zhǎng)密度，菌落數(shù)適宜濃度30～300。

1.2.4.2 抑菌菌株篩選 雙層平辦法：倒入MRS瓊脂培養(yǎng)基作為下層平板，將分離得到的乳酸菌在MRS平板劃2條長(zhǎng)2cm的平行直線(xiàn)，37℃恒溫培養(yǎng)24h，至長(zhǎng)出菌苔，再倒入含有霉菌孢子的PDA瓊脂培養(yǎng)基作為上層平板，28℃恒溫培養(yǎng)2d，以接種霉菌孢子但不接種乳酸菌為空白對(duì)照，觀(guān)察霉菌生長(zhǎng)面積，測(cè)量計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式如下：

抑菌率（%）=（S-SM1）/（S-SM0）×100 （1）

式中：S為平板總面積，cm2;SM1為試驗(yàn)組霉菌生長(zhǎng)面積，cm2; SM0為對(duì)照組霉菌生長(zhǎng)面積，cm2。

1.2.5 抑菌乳酸菌理化鑒定

1.2.5.1 明膠液化試驗(yàn) 將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后，按照1%的接種量接種于明膠基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株接10支試管，每支以不接種的試管為空白對(duì)照。在37℃恒溫厭氧培養(yǎng)，每隔2d分別取2支試管和空白組進(jìn)行觀(guān)察。先將試管置于冰箱冷凍至空白組凝固，若空白組培養(yǎng)基凝固而試驗(yàn)組培養(yǎng)基不凝同，則為明膠液化陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.5.2 產(chǎn)生試驗(yàn) 將濾紙剪成約0.5～0.6cm寬的紙條，長(zhǎng)度根據(jù)試管而定，用80g/L乙酸鉛溶液浸潤(rùn)，烘干。將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后，按照1%的接種量接種于硫化氫培養(yǎng)基中，鑷子子夾取1 一條乙酸鉛紙條，懸掛于接種試管內(nèi)，下端靠近培養(yǎng)液，以上部分不接觸，用棉塞塞緊，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h，在不接種的試管內(nèi)懸掛紙條作為空白對(duì)照。觀(guān)察紙條是否有黑色物質(zhì)產(chǎn)生，若有為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.5.3 吲哚試驗(yàn) 將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后，按照1%的接種量接種于H2S液體培養(yǎng)基中，并設(shè)置空白對(duì)照。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)4d后，沿管壁緩慢加入吲哚試劑數(shù)滴，觀(guān)察分界處若有紅色產(chǎn)生，則為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.5.4 淀粉水解試驗(yàn) 將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后，用無(wú)菌生理鹽水稀釋105倍，吸取0.1 mL涂布于淀粉培養(yǎng)基上，并設(shè)空白對(duì)照。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)2d長(zhǎng)出菌苔后，向平板上滴加碘液，觀(guān)察顏色變化。若空白組明顯變藍(lán)，而試驗(yàn)組無(wú)明顯顏色變化，則為淀粉水解酶陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.5.5 V-P試驗(yàn)（乙酰甲基甲醇試驗(yàn)）將斜面保藏的菌株2次傳代培養(yǎng)后，按照1%的接種量接種于V-P試驗(yàn)培養(yǎng)基中，并設(shè)空白對(duì)照。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24h后，取2mL培養(yǎng)液加入等體積的40%氫氧化鈉溶液混勻，再加入1mg肌酸，充分振蕩后靜置30～60min，觀(guān)察顏色變化，若顏色變紅，則為陽(yáng)性，否則為陰性。

1.2.5.6 乳酸菌碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn) 將斜面保存的乳酸菌菌種接種至MRS液體培養(yǎng)基，2次傳代培養(yǎng)后，去0.05mL培養(yǎng)液接種至碳水化合物發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃恒溫厭氧培養(yǎng)（表1）。結(jié)果判定：陽(yáng)性結(jié)果為培養(yǎng)基中的顏色變黃;弱陽(yáng)性結(jié)果為培養(yǎng)基的顏色部分變黃;陰性結(jié)果為顏色不變，與不含糖類(lèi)的對(duì)照管相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌分離結(jié)果 根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況，稀釋濃度為10-5，選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。菌落為乳白色，表面光滑，呈圓形，酸黃瓜和泡椒中菌株為桿狀，蘿卜中菌株為球狀。3種樣品中的菌落，蘿卜中菌株沒(méi)有溶鈣圈，泡椒中有20株，酸黃瓜中有25株。對(duì)具溶鈣圈菌株進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果共有40株G+、5株G-。再對(duì)40株G+菌株進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)，結(jié)果都為陰性，可初步確定為乳酸菌，分別編號(hào)為P1～16，S1～24，轉(zhuǎn)接至試管斜面保存。

2.2 菌株篩選結(jié)果 通過(guò)觀(guān)察涂布霉菌孢子的平板菌落數(shù)，霉菌孢子懸浮液1 mL稀釋100倍，涂布0.1 mL菌落數(shù)較為合適。通過(guò)雙層平辦法，結(jié)果顯示共有3株菌株（S1，S6， P5）對(duì)黑曲霉菌抑制效果較顯著，2株菌株（S6，S7）對(duì)黃曲霉抑制作用較顯著，S1對(duì)黑曲霉抑菌率為26%，S6對(duì)黑曲霉抑菌率為36%，P5對(duì)黑曲霉抑菌率為28%，S6對(duì)黃曲霉抑菌率為24%，S7對(duì)黃曲霉抑菌率為23%。

2.3 生理生化鑒定結(jié)果 由表2和表3可知，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》鑒定，菌株S1、S7為發(fā)酵乳桿菌，S6、P3為植物乳桿菌。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以3份市售醬菜為材料，分離得到45株疑似乳酸菌;經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，其中40株菌株初步確定為乳酸菌;以黑曲霉菌和黃曲霉菌為指示菌，采用雙層平辦法篩選出4株具有抑制霉菌活性菌株;通過(guò)生理生化鑒定和糖發(fā)酵試驗(yàn)，鑒定菌株分別為發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌。

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（責(zé)編：張宏民）

基金項(xiàng)目：山西省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2019L0980）;山西省高等學(xué)校教學(xué)改革創(chuàng)新項(xiàng)目（J2016114）;呂梁學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：李利紅（1984-），女，山西臨縣人，研究方向：微生物生理。 *通訊作者

收稿日期：2020-06-30