發(fā)酵支原體MALP-2生物學(xué)作用研究進(jìn)展

梁珂瑩，劉 君,#，曾焱華，何 軍*

(1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 衡陽 421002；2.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所，特殊病原體防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽 421001)

發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans,Mf)是一類缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，具有可塑多形性。Mf常寄居于健康人群及先天免疫缺陷患者的黏膜部位，能引起呼吸道疾病、關(guān)節(jié)炎、泌尿生殖道感染及慢性疲勞綜合癥等疾病，并與人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染發(fā)展存在一定的相關(guān)性。Mf的膜脂蛋白被認(rèn)為是其主要的免疫原，可直接參與和宿主的相互作用，成為Mf主要致病因素之一。在這些致病相關(guān)膜結(jié)構(gòu)分子中，巨噬細(xì)胞活化脂肽-2(Macrophage-activating lipopeptide-2,MALP-2)能夠活化巨噬細(xì)胞，且常作為支原體膜脂蛋白的代表分子得到廣泛研究，本文就MALP-2的生物學(xué)作用的最新研究進(jìn)展作一綜述。

1 MALP-2的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

與其它支原體一樣，Mf的細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)雙分子層和膜蛋白組成，膜蛋白又包括膜本體蛋白和外周膜蛋白。前者緊密鑲嵌于細(xì)胞膜中，需要用去污劑才能分離；后者又被稱為膜脂蛋白，靠靜電作用與膜連接，容易釋放。MALP-2與很多支原體脂蛋白的結(jié)構(gòu)相似，其N端有一個二酰甘油-半胱氨酸結(jié)構(gòu)，通過二酰甘油的兩條脂肪酸鏈錨定于細(xì)胞膜上，并且可通過人工合成獲得，避免了直接提取脂蛋白被內(nèi)毒素污染的風(fēng)險[1-2]。絕大多數(shù)細(xì)菌脂蛋白(Bacterial lipoproteins,BLP)N端為三酰化半胱氨酸殘基，而MALP-2的N端為二?；腚装彼釟埢@可能是導(dǎo)致兩者致病機(jī)制不同的主要原因之一[3]。MALP-2與模擬合成的二酰脂肽Pam2CSK4具有相同的脂質(zhì)部分，但其多肽部分不同，從而導(dǎo)致對自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell,NK細(xì)胞)活化作用存在差異[4]。MALP-2、BLP與Pam2CSK4的分子結(jié)構(gòu)比較見圖1。由此推測，MALP-2與其它物質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)上的差異決定了其作用位點(diǎn)及作用方式的特異性。

圖1 MALP-2、BLP與Pam2CSK4的分子結(jié)構(gòu)圖A：MALP-2分子結(jié)構(gòu)圖；B：Pam2CSK4分子結(jié)構(gòu)圖；C：BLP分子結(jié)構(gòu)圖

2 MALP-2的生物學(xué)作用

MALP-2作為脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(Lipid associated membrane proteins,LAMPs)的代表被廣泛應(yīng)用到研究中，具有非常重要的生物活性作用。支原體的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白作為其致病的主要毒力因子，常與單核/巨噬細(xì)胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)結(jié)合，激活絲裂原蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)以及核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB)和激活子蛋白-1(Activator protein 1,AP-1)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素1(Interleukin 1,IL-1)、白細(xì)胞介素6(Interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,TNF)等[5]。TLR6協(xié)同TLR2識別并結(jié)合MALP-2，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號通路，發(fā)揮其生物活性作用，二者在特定細(xì)胞表面的表達(dá)決定了MALP-2作用細(xì)胞的類型。但MALP-2的作用并不局限于表達(dá)TLR2及TLR6的細(xì)胞，提示MALP-2并不只依賴TLR2/6途徑發(fā)揮其生物活性作用，可能還存在其它介導(dǎo)途徑。MALP-2的生物學(xué)作用是多方面的，本文從以下幾個方面進(jìn)行闡述。

2.1 致炎與抗炎作用

MALP-2結(jié)合TLR2/6激活NF-κB通路可誘導(dǎo)羊膜間充質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6、白細(xì)胞介素8(Interleukin 8,IL-8)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胎膜早破[6]。有文獻(xiàn)報道，MALP-2不僅誘導(dǎo)激活臍帶的間充質(zhì)干細(xì)胞中IL-1β、白細(xì)胞介素4(Interleukin 4,IL-4)、IL-6、TNF-α及趨化因子配體CCL1、CCL4等細(xì)胞因子的表達(dá)，也誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞趨化因子IL-8及生長調(diào)節(jié)致癌基因GRO-α與單核細(xì)胞趨化因子MCP-1、MIP-1α及MIP-1β的產(chǎn)生，促進(jìn)白細(xì)胞浸潤[7]。除此之外，MALP-2可誘導(dǎo)大量中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞在小鼠肺組織浸潤，并能顯著誘導(dǎo)肺血管中血管細(xì)胞粘附分子-1的表達(dá)[8]。MALP-2能誘導(dǎo)細(xì)胞因子、一氧化氮產(chǎn)生及使抗原呈遞細(xì)胞成熟[9]，也可上調(diào)樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)表面簇分化抗原CD40、CD54、CD80、CD83、CD86、人類白細(xì)胞抗原HLA-ABC及主要組織相容性復(fù)合體MHCⅡ的表達(dá)，誘導(dǎo)DC成熟，使其發(fā)揮抗原呈遞等作用[10-11]。Mitsunari M等[12]人發(fā)現(xiàn)，MALP-2經(jīng)NF-κB及MAPK通路介導(dǎo)人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞以濃度依賴的方式誘導(dǎo)產(chǎn)生環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)及其代謝產(chǎn)物前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)。此外，MALP-2經(jīng)TLR2/6及NF-κB通路誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞表達(dá)誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)[13]。MALP-2還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞NADPH氧化酶NOX2及其產(chǎn)物活性氧ROS的生成，上調(diào)GM-CSF的釋放[14]。以上研究表明，MALP-2通過激活細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥相關(guān)酶及其代謝產(chǎn)物等多種炎癥相關(guān)因子從而發(fā)揮致炎作用。

有趣的是，MALP-2能減低過敏性哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)，顯著刺激小鼠肥大細(xì)胞分泌生物調(diào)節(jié)因子白細(xì)胞介素10(Interleukin 10,IL-10)[15]。MALP-2經(jīng)MAPK及Nrf2通路誘導(dǎo)人單核細(xì)胞血紅素加氧酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)COX-2表達(dá)，以及經(jīng)TLR2/6、Btk、Mal及c-Src通路激活PI3K，進(jìn)而激活Nrf2，誘導(dǎo)HO-1的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其抗炎作用[16-17]。由此可見，MALP-2除了激發(fā)炎癥反應(yīng)，還可下調(diào)炎癥反應(yīng)，盡管調(diào)控的炎癥因子不盡相同，但對機(jī)體也具有類似雙重調(diào)控作用。

2.2 細(xì)胞凋亡與抗凋亡作用

Into T等[18]發(fā)現(xiàn)，MALP-2經(jīng)TLR2/6與NF-κB通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其NF-κB通路由MyD88/FADD部分介導(dǎo)，而細(xì)胞凋亡受p38 MAPK與MyD88/FADD調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)報道稱，MALP-2抑制線粒體膜電位的降低，下調(diào)活化的Caspase-8，從而抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[19]。另外，MALP-2也對中性粒細(xì)胞的細(xì)胞凋亡發(fā)揮短效的抑制作用[20]。因此，MALP-2除了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡外，亦可對細(xì)胞凋亡進(jìn)行負(fù)向調(diào)控，這可能隨MALP-2誘導(dǎo)濃度，宿主類型及誘導(dǎo)途徑的不同而不同，也有待于進(jìn)一步證實(shí)。

2.3 免疫佐劑作用

MALP-2衍生物可以在結(jié)核分枝桿菌感染者中誘導(dǎo)DC分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子，增強(qiáng)機(jī)體對T細(xì)胞和B細(xì)胞的處理和抗原呈遞能力，增強(qiáng)抗原的記憶適應(yīng)性免疫同時還可以抑制小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)肺結(jié)核分枝桿菌的存活，是黏膜和系統(tǒng)性疫苗制劑中極具前途的候選佐劑[21]。MALP-2還可與HIV Tat蛋白、麻疹病毒及化膿性鏈球菌相關(guān)成分組成聯(lián)合疫苗可增強(qiáng)疫苗效果[22-24]。在COX-2阻滯劑抑制PGE2產(chǎn)生的情況下，MALP-2誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ誘導(dǎo)蛋白IP-10，進(jìn)而顯著增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性，有望成為腫瘤治療的免疫佐劑[25]。MALP-2應(yīng)用于肺部腫瘤的免疫治療時，可通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞免疫功能抑制腫瘤以降低癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險[26]。在小鼠感染流感病毒后的肺炎鏈球菌二重感染模型中，MALP-2的局部免疫刺激能夠增強(qiáng)肺組織的細(xì)菌清除能力并提高其生存率[27]。以上證據(jù)表明，MALP-2有希望成為一種理想的免疫佐劑。

2.4 生物協(xié)同作用

研究發(fā)現(xiàn)，MALP-2可上調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的人肺纖維母細(xì)胞IL-6、CXCL1及CXCL8等免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)[28]。MALP-2促進(jìn)干擾素-γ上調(diào)黑色素瘤細(xì)胞趨化因子CXCL10的表達(dá)[29]。纖維蛋白能上調(diào)MALP-2介導(dǎo)的單核細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6、TNF-α與趨化因子MIP-1α、MCP-1[30]。硫酸鎳與MALP-2顯著上調(diào)人肺纖維母細(xì)胞趨化因子CXCL8、COX-2及其代謝產(chǎn)物PGE2的表達(dá)，并抑制MALP-2介導(dǎo)的趨化因子CXCL10表達(dá)[31]。鎳與MALP-2經(jīng)低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)及COX-2通路協(xié)同上調(diào)人肺纖維母細(xì)胞趨化因子CXCL1、CXCL5及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)其血管生成及纖維化[32]。CD47與MALP-2經(jīng)MyDD信號通路協(xié)同調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞遷移[33]?？梢姡琈ALP-2可與多種物質(zhì)發(fā)生生物協(xié)同作用，從而進(jìn)一步提高生物活性作用。

2.5 生物抑制作用

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過MALP-2預(yù)處理的小鼠巨噬細(xì)胞通過影響TLR-MyD88依賴信號通路，使脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)反應(yīng)中產(chǎn)生TNF-α減少并且損害LPS誘導(dǎo)的NF-κB和c-Jun NH2末端激酶的激活，造成小鼠巨噬細(xì)胞對LPS的耐受，反之亦然[34]。有趣的是，其它物質(zhì)對MALP-2還具有抑制作用。阿托伐他汀明顯抑制MALP-2介導(dǎo)的冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞活化，其機(jī)制涉及酪蛋白激酶2及SP1的磷酸化[35]。崗松及其有效成分經(jīng)MyD88及NF-κB通路抑制由MALP-2刺激小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生的細(xì)胞炎癥反應(yīng)及iNOS的表達(dá)[36]。補(bǔ)骨脂乙素能抑制MALP-2介導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞iNOS表達(dá)[37]，也能抑制MALP-2介導(dǎo)的大腦內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)的表達(dá)[38]。卷曲乳桿菌2029抑制MALP-2介導(dǎo)的宮頸上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)[39]。1,6-二磷酸果糖抑制MALP-2介導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)[40]。從以上抑制和被抑制作用來看，MALP-2可能存在能與多種物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)的多個位點(diǎn)以及如何抑制其生物活性是一個值得探索的方向。

2.6 血管損傷和血管修復(fù)作用

已證實(shí)肺炎支原體感染與動脈粥樣硬化存在一定的關(guān)系。Curtiss LK[41]報道稱，MALP-2經(jīng)TLR2/6受體使血漿促炎細(xì)胞因子IL-12、IL-23 p40的水平升高，誘導(dǎo)了小鼠的全身炎癥反應(yīng)，使其表現(xiàn)出更高的血漿膽固醇水平，最終導(dǎo)致心臟瓣膜病變。同時，MALP-2還經(jīng)TLR2/6、NF-κB及ZNF202通路下調(diào)人巨噬細(xì)胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1的表達(dá)，進(jìn)而抑制膽固醇外流，導(dǎo)致動脈粥樣硬化的形成[42]。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)支原體能影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

然而有文獻(xiàn)報道，MALP-2經(jīng)TLR2/6介導(dǎo)白細(xì)胞遷移以及GM-CSF和VEGF分泌，顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及導(dǎo)管形成，進(jìn)而加速血管生成[43-44]。不僅如此，MALP-2增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放，改善了NO依賴性的血管舒張、內(nèi)皮粘附分子表達(dá)以及單核細(xì)胞粘附，而巨噬細(xì)胞的積累和內(nèi)皮細(xì)胞增殖增加了側(cè)支管直徑，促進(jìn)側(cè)支生長，在功能上改善了缺血小鼠后肢的灌注恢復(fù)。MALP-2促進(jìn)血管生成大多依賴于生長因子GM-CSF的誘導(dǎo)，這有望成為血管修復(fù)的一種新的促進(jìn)劑[45]。

3 總結(jié)與展望

MALP-2通過結(jié)合TLR2/6激活NF-κB、MAPK等通路，激發(fā)或下調(diào)炎癥因子的分泌以達(dá)到對炎癥反應(yīng)的雙重調(diào)控；不僅如此，MALP-2通過由p38 MAPK和MyD88/FADD介導(dǎo)的NF-κB通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，又可以抑制線粒體膜電位的降低，來抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞的凋亡也具有雙重調(diào)控作用；同時，MALP-2既可以誘導(dǎo)小鼠的全身炎癥反應(yīng)，使其表現(xiàn)出更高的血漿膽固醇水平，造成對血管損傷，又可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及導(dǎo)管形成，進(jìn)而加速血管生成，這也體現(xiàn)出MALP-2對血管作用的雙面性。MALP-2還可以通過誘導(dǎo)一些細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子和趨化因子，增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，有望成為腫瘤治療以及黏膜和系統(tǒng)性疫苗制劑中的免疫佐劑。MALP-2表現(xiàn)可與硫酸鎳、阿托伐他汀、補(bǔ)骨脂乙素等多種物質(zhì)相互作用，從而進(jìn)一步提高或抑制生物活性作用。MALP-2除了具有以上各種生物學(xué)作用外，還可經(jīng)TLR2、TAK1及NF-κB通路上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞鈣蛋白酶抑素的表達(dá)。此外，Tschernig T等[46]發(fā)現(xiàn)MALP-2能夠調(diào)節(jié)肺組織微囊蛋白1及足細(xì)胞標(biāo)記蛋白的表達(dá)，對更深入地研究肺部炎癥反應(yīng)機(jī)制很有幫助。盡管以上諸多研究存在局限性甚至對立面，但這些研究為課題組成員更好地理解MALP-2的致病性及支原體的致病機(jī)制提供了更多的途徑和研究方向。對MALP-2的深入了解將為支原體的致病機(jī)制研究及MALP-2的臨床應(yīng)用翻開新的篇章。