保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)

李 蕊，馬玉忠，李睿文，汪恩強(qiáng)

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001）

子宮內(nèi)膜炎目前仍是奶牛最常見(jiàn)的繁殖障礙性疾病之一，大多發(fā)于圍產(chǎn)期，各種原因引起的病原菌感染是最常見(jiàn)的原因，導(dǎo)致產(chǎn)犢周期延長(zhǎng)，奶產(chǎn)量和奶品質(zhì)降低，奶牛不孕和不育等［1］，給奶牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，我國(guó)每年因奶牛子宮內(nèi)膜炎損失上億元［2］。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病菌種類繁雜，尤其是近十幾年，由于各地濫用抗生素藥物，導(dǎo)致耐藥菌株增多［3］，給臨床治療奶牛子宮內(nèi)膜炎帶來(lái)諸多困難。由于該病致病菌種類因地區(qū)而異，故對(duì)保定市部分地區(qū)患牛進(jìn)行致病菌分離鑒定，查明當(dāng)?shù)啬膛Ｗ訉m內(nèi)膜炎主要致病菌種類，并通過(guò)藥敏試驗(yàn)探索有效治療藥物，為防治該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在保定市6 個(gè)區(qū)縣的14 個(gè)奶牛場(chǎng)中，按照奶牛子宮內(nèi)膜炎診斷依據(jù)，并據(jù)臨床癥狀與發(fā)情情況以及直腸檢查結(jié)果，選取76 頭經(jīng)確診患臨床型子宮內(nèi)膜炎的奶牛，無(wú)菌采集子宮內(nèi)容物，用于奶牛子宮內(nèi)膜炎的細(xì)菌分離鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)用品和試劑

蘇州凈化SW-CJ-2D 型超凈工作臺(tái)；上海精宏HZP-250 型全溫振蕩培養(yǎng)箱；上海精宏DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；CKX41-A32RC 型奧林巴斯顯微鏡；美的低溫電冰箱；鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、生物酪蛋白瓊脂培養(yǎng)平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基等；藥敏試紙片（青霉素、新霉素、鏈霉素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氨芐西林、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、頭孢西丁、頭孢噻肟、氟苯尼考），均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；微量生化鑒定管（葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、V-P 試驗(yàn)、M-R 試驗(yàn)、尿素、過(guò)氧化氫酶、吲哚試驗(yàn)、亞硝酸鹽還原試驗(yàn)），杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；高壓滅菌器，無(wú)菌小試管，染色液等。

1.3 致病菌分離鑒定

1.3.1 樣本的采集將臨床型子宮內(nèi)膜炎患牛行保定架保定，用0.3% 的K2MnO4溶液沖洗外陰，運(yùn)用直腸把握法將滅菌輸精管插入子宮內(nèi)部，輸精管外側(cè)端連接裝有30 mL 生理鹽水的無(wú)菌注射器，反復(fù)抽吸，將吸取至注射器內(nèi)的子宮沖洗液快速轉(zhuǎn)移至無(wú)菌試管內(nèi)，并做好標(biāo)記，放入低溫保溫箱送檢。

1.3.2致病菌分離培養(yǎng)將采集的子宮沖洗液樣品分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯和鮮血瓊脂培養(yǎng)基中，進(jìn)行有氧和厭氧鑒定培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄培養(yǎng)物的生長(zhǎng)特點(diǎn)以及菌落形態(tài)。同時(shí)，挑取生長(zhǎng)特點(diǎn)不同的單菌落進(jìn)行涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌的染色特性和形態(tài)結(jié)構(gòu)。根據(jù)培養(yǎng)物細(xì)菌的鏡檢結(jié)果，結(jié)合菌落的生長(zhǎng)特點(diǎn)和形態(tài)，選擇特征性的菌落分別接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、生物酪蛋白瓊脂培養(yǎng)平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基等，置37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行純培養(yǎng)，供細(xì)菌鑒定用。

1.3.3 致病菌鑒定培養(yǎng)特性鑒定：細(xì)菌經(jīng)上述培養(yǎng)基純培養(yǎng)后，觀察菌落生長(zhǎng)情況、菌落形態(tài)特征，以及經(jīng)普通肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)后，觀察肉湯的透明度和渾濁度，管底有無(wú)沉淀及沉淀的特征等。

染色鏡檢鑒定：細(xì)菌涂片，革蘭染色鏡檢，根據(jù)細(xì)菌染色特性和細(xì)菌大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)等特征進(jìn)行鑒定。

生化鑒定：經(jīng)培養(yǎng)特性和染色鏡檢初步鑒定的菌株進(jìn)一步生化鑒定，記錄鑒定結(jié)果。

1.4 藥敏試驗(yàn)

運(yùn)用藥敏紙片擴(kuò)散法，即Kirby-Barer 法［4］分別對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。挑選經(jīng)分離、純化及鑒定的各類菌株，各選取15 株使用生理鹽水稀釋至1.5×108CFU/mL，吸取100 μL 稀釋液移至生物酪蛋白瓊脂培養(yǎng)平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)10 min，在平板表面平鋪藥敏紙片，各平皿中分別放置5 張，各菌種均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。將放有藥敏紙片的平皿37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，使用游標(biāo)卡尺對(duì)抑菌圈直徑進(jìn)行測(cè)量并記錄。結(jié)果參照CLSI 藥敏試驗(yàn)國(guó)標(biāo)進(jìn)行判定［5］，分為耐藥珠（R）、敏感株（S）及中敏株（I）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t 檢驗(yàn)，P ＞0.05 表示差異不顯著，P ＜0.05表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌感染情況

從76 份子宮分泌物樣品中，有73 份分離出細(xì)菌，致病菌的檢出率為96.1%。其中單一致病菌感染樣本14 份，感染率為18.4%，多致病菌感染樣本59 份，感染率為77.6%（見(jiàn)表1），可見(jiàn)多致病菌感染的奶牛子宮內(nèi)膜炎極顯著高于單一致病菌感染（P ＜0.01）。

表1 奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌感染情況Table 1 Pathogenic bacteria infection of dairy cow endometritis

2.2 奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌鑒定結(jié)果

對(duì)保定市子宮內(nèi)膜炎患牛分離出的致病菌進(jìn)行菌落形態(tài)特征、生長(zhǎng)特性觀察以及革蘭氏染色鏡檢，初步鑒定出7 類致病菌，分別為鏈球菌、葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、大腸埃希菌、屎腸球菌、綠膿桿菌和棒狀桿菌（見(jiàn)表2）。

對(duì)初步分離鑒定的致病菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 奶牛子宮內(nèi)膜炎致菌病初步鑒定結(jié)果Table 2 Preliminary identification results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis

表3 致病菌生化鑒定結(jié)果Table 3 Biochemical identification results of pathogenic bacteria

綜合致病菌初步鑒定和生化試驗(yàn)結(jié)果，共鑒定出8 種48 株致病菌（見(jiàn)表4），不同致病菌的感染率差異極顯著（P ＜0.01），其中金黃色葡萄糖球菌的檢出率最高，占27.1%（13/48），其次是鏈球菌和大腸埃希菌，分別占20.8%（10/48）和18.8%（9/48），3 種致病菌的檢出率顯著高于其他致病菌（P ＜0.05 或P ＜0.01）。

表4 奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis

2.3 子宮內(nèi)膜炎致病菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離鑒定的8 種子宮內(nèi)膜炎致病菌分別用14 抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，新霉素、氟苯尼考、諾氟沙星、頭孢西丁和頭孢噻肟均對(duì)主要致病菌金黃色葡萄糖球菌、鏈球菌和大腸埃希菌高度敏感，而對(duì)青霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、慶大霉素、卡那霉素等表現(xiàn)不同程度的耐藥。

表5 奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Drug sensitivity test results of pathogenic bacteria of dairy cow endometritis

3 討論

3.1 奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌分離鑒定

奶牛子宮內(nèi)膜炎嚴(yán)重影響奶牛業(yè)發(fā)展，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原很多，有細(xì)菌、病毒、真菌、支原體等，但報(bào)道最多的主要是細(xì)菌，因?yàn)槟膛７置诤笞訉m頸口處于開(kāi)放狀態(tài)，環(huán)境中的細(xì)菌很容易進(jìn)入子宮內(nèi)，再加上子宮內(nèi)適宜的溫度、濕度和酸堿度，為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖提供了保障，因此應(yīng)加強(qiáng)圍產(chǎn)期奶牛的飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生，切斷奶牛子宮內(nèi)膜炎的傳染源，是有效預(yù)防奶牛子宮內(nèi)膜炎的關(guān)鍵措施。

由于地區(qū)不同，環(huán)境各異，引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的細(xì)菌分布特點(diǎn)也不相同，這可能與各地區(qū)氣候環(huán)境特點(diǎn)、飼養(yǎng)管理水平、奶牛自身子宮和陰道內(nèi)環(huán)境以及免疫調(diào)節(jié)水平等因素有著密切聯(lián)系。胡文舉等2014 年研究發(fā)現(xiàn)，河南平頂山地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為蠟樣芽孢桿菌，大腸埃希菌，奧斯陸莫拉菌等［6］；趙清梅等2015 年研究發(fā)現(xiàn)，寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為大腸埃希菌55.56%，金黃色葡萄球菌35.9%［7］；王軍等2018年研究發(fā)現(xiàn)，鄭州市奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、產(chǎn)吲哚金黃桿菌、蠟樣芽孢桿菌［8］；戴浩楠等2016 年研究發(fā)現(xiàn)，雁門關(guān)地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌為芽孢桿菌30.56%，大腸埃希菌14.81%，腸球菌12.96%，葡萄球菌9.26%，鏈球菌6.48%［9］。本試驗(yàn)從76 份保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎子宮分泌物樣本中，有73 份檢出致病菌。對(duì)致病菌進(jìn)行分離鑒定，共鑒定出8種致病菌，主要致病菌為葡萄球菌（37.5%）、鏈球菌（20.8%）和大腸埃希菌（18.8%），且保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎大多為多致病菌混合感染，這與陳星、凌丁、陳強(qiáng)、李宏勝等人的報(bào)道結(jié)果不同［10-13］，可見(jiàn)各地區(qū)致病菌的感染類型各異，可能與地區(qū)差異、飼養(yǎng)管理水平及奶牛自身品種和體質(zhì)不同相關(guān)。

3.2 奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌的高度敏感性藥物為諾氟沙星、氟苯尼考、新霉素、頭孢西丁和頭孢噻肟，青霉素、四環(huán)素和復(fù)方新諾明為不敏感藥物，該試驗(yàn)結(jié)果對(duì)保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎的防治可提供有力的科學(xué)依據(jù)。關(guān)于致病菌對(duì)某些藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象，可能由于奶牛臨床上濫用抗生素藥物所致，建議完善飼養(yǎng)管理體制，制定安全、合理用藥規(guī)則；增強(qiáng)預(yù)防意識(shí)，重視對(duì)疫苗、微生態(tài)制劑和中獸藥等藥物的研發(fā)及投入使用?？刂茖?duì)于抗生素的使用，采用輪換、穿插用藥的方式，減少耐藥性藥物的產(chǎn)生。定期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒定及探究，及時(shí)了解并使用效果最佳藥物，提高治愈率。