電子束輻照對(duì)高聚原花青素聚合度的影響

汪宇煒，林柳月，胡詩婷，汪瀾，劉潔,2*

（1.湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院，湖北咸寧 437100；2.輻射化學(xué)與功能材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北咸寧 437100）

原花青素（Proanthocyanidins，PC）是一種常見的聚多酚類黃酮，廣泛存在于自然界的植物中，如葡萄籽中原花青素含量很豐富[1]。研究表明，葡萄籽原花青素具有良好的抗氧化功能，可以很好地清除自由基，醫(yī)治一些由自由基造成的疾病，還有抗毒消炎、防治心血管疾病等功效[2-3]。按聚合度差異可將原花青素分為3類：聚合度為1的單體，具體包括表兒茶素、沒食子酸、兒茶素等，聚合度在2～4的稱為低聚原花青素，聚合度在5以上的稱為高聚原花青素[4]。高聚原花青素的分子量比低聚體大，受到空間位阻的影響更大，其抗氧化能力往往低于低聚體[5]。因此，為了使原花青素的利用效益達(dá)到最大化，有必要對(duì)高聚原花青素進(jìn)行降解處理來提高其使用價(jià)值。

目前，降解高聚原花青素主要有化學(xué)降解法、生物降解法和物理降解法[6-8]。電子束輻照降解作為物理法的一種，具有方便、清潔且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。已有研究采用電子束輻照技術(shù)降解高分子聚合物和有機(jī)小分子，而利用電子束輻照降解高聚原花青素卻未見報(bào)道。本研究采用電子束輻照的方法來降解高聚原花青素，對(duì)經(jīng)過不同劑量電子束輻照后的高聚原花青素樣品，用香草醛鹽酸法測(cè)定其平均聚合度的變化，以期為電子束輻照原花青素的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

98%葡萄籽高聚原花青素，西安艾諾醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司；香草醛、冰乙酸、鹽酸、無水乙醇、甲醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；（+）-兒茶素，分析純，sigma試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7200可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯有限公司；UV-2300紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司；AYU-120分析天平，日本島津公司；1 MeV電子加速器，美國(guó)沃氏公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高聚原花青素的提純

稱取一定量葡萄籽高聚原花青素，按照原花青素固體與乙醇1∶200（g∶mL）的固液比，用無水乙醇溶解原花青素固體，靜置12 h，過濾，濾液在45 ℃旋蒸去除乙醇，旋蒸后得到的固體置于45 ℃紅外干燥箱干燥，即為接下來實(shí)驗(yàn)要用到的高聚原花青素樣品。

1.3.2 電子束輻照處理

準(zhǔn)備6個(gè)密封袋，分別稱取0.2 g高聚原花青素樣品，置入密封袋中平鋪均勻，用膠帶封口固定，并送樣輻照。輻照總劑量設(shè)定為90 kGy、180 kGy、210 kGy、270 kGy、330 kGy和 390 kGy，劑量率為30 kGy/s。

1.3.3 香草醛鹽酸法測(cè)定高聚原花青素平均聚合度

1.3.3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

取10 mL具塞比色管，依次加入1.0 mL原花青素甲醇溶液、5.0 mL香草醛甲醇溶液和1.5 mL鹽酸甲醇溶液，用無水甲醇定容至刻度，加塞振蕩使其混合均勻，避光反應(yīng)20 min后，立即于360～650 nm范圍掃描吸收光譜，據(jù)此選擇測(cè)定波長(zhǎng)。另取10 mL具塞比色管，依次加入1.0 mL原花青素乙酸溶液、5.0 mL香草醛乙酸溶液和1.5 mL鹽酸乙酸溶液，用乙酸定容至刻度，加塞振蕩使其混合均勻，避光反應(yīng)5 min后，立即于360～650 nm范圍掃描吸收光譜，據(jù)此選擇測(cè)定波長(zhǎng)。

1.3.3.2 顯色條件單因素實(shí)驗(yàn)

按照“1.3.3.1”配制顯色溶液，依次改變香草醛溶液和原花青素溶液體積比為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1，分別考察顯色溶液避光恒溫20 ℃、30 ℃和40 ℃情況下30 min內(nèi)吸光度的變化情況（每次實(shí)驗(yàn)測(cè)3次，結(jié)果取平均值，以下均同），確定香草醛溶液和原花青素溶液最佳體積比、最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用（+）-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，在香草醛與標(biāo)準(zhǔn)品最佳反應(yīng)體積比以及最佳反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間條件下，配制不同濃度的（+）-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)顯色系列溶液，測(cè)定每份溶液的吸光度值，分別繪制吸光度值與（+）-兒茶素甲醇溶液質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度值與（+）-兒茶素乙酸溶液物質(zhì)的量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.4 平均聚合度的測(cè)定

將輻照前后的原花青素樣品分別用甲醇和乙酸溶解，配制成一定濃度，在相同條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)并測(cè)定吸光度值，所得的吸光度數(shù)據(jù)代入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到比色管中溶液的濃度，進(jìn)而換算出樣品溶液的濃度，再按照公式1計(jì)算原花青素的平均聚合度[9]。

式中，m為原花青素的質(zhì)量，μg；n為原花青素物質(zhì)的量，μmol；M為（+）-兒茶素的相對(duì)分子質(zhì)量（290 g/mol）。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

圖1為原花青素-香草醛在甲醇體系和乙酸體系中的可見吸收光譜圖。由圖1可知，兩者均在500 nm處吸收最強(qiáng)。因此，測(cè)定高聚原花青素平均聚合度的實(shí)驗(yàn)中，均可選擇500 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 原花青素-香草醛體系可見吸收光譜圖

2.2 香草醛-原花青素體積比和反應(yīng)時(shí)間的確定

甲醇體系中，香草醛-原花青素體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1時(shí)，顯色溶液在500 nm處的吸光度值隨時(shí)間變化如圖2所示。由圖2可知，加入的香草醛甲醇溶液與原花青素甲醇溶液體積比為4∶1時(shí)，反應(yīng)在20 min基本完成且吸光度值最穩(wěn)定。因此實(shí)驗(yàn)選取香草醛甲醇溶液和原花青素甲醇溶液體積比為4∶1，反應(yīng)時(shí)間為20 min。

圖2 甲醇體系中不同香草醛-原花青素體積比時(shí)吸光度值隨時(shí)間變化

乙酸體系中，香草醛-原花青素體積比分別為2∶1、3∶1、4∶1和5∶1時(shí)，顯色溶液在500 nm處的吸光度值隨時(shí)間變化如圖3所示。由圖3可知，加入的香草醛乙酸溶液與原花青素乙酸溶液體積比為3∶1時(shí)，反應(yīng)在5 min基本完成。因此，實(shí)驗(yàn)選取香草醛乙酸溶液和原花青素乙酸溶液體積比為3∶1，反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.3 反應(yīng)溫度的確定

在上述條件下分別考察甲醇體系顯色溶液在20 ℃、30 ℃和40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)20 min后吸光度值的變化，以及乙酸體系顯色溶液在20 ℃、30 ℃和40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)5 min后吸光度值的變化，發(fā)現(xiàn)吸光度值均隨反應(yīng)溫度升高而降低（圖4）。因此均選擇20 ℃作為反應(yīng)溫度。

圖3 乙酸體系中不同香草醛-原花青素體積比時(shí)吸光度值隨時(shí)間變化

圖4 反應(yīng)溫度的影響

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以（+）-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，在甲醇體系中采用香草醛鹽酸法測(cè)定原花青素的質(zhì)量，得到吸光度與（+）-兒茶素質(zhì)量濃度（μg/mL）之間的線性方程為y=0.001 37x-0.022 6，R=0.998 1；在乙酸體系中采用香草醛鹽酸法測(cè)定原花青素物質(zhì)的量，得到吸光度與（+）-兒茶素物質(zhì)的量濃度（μmol/mL）之間的線性方程為y=32.244 7x-0.217 5，R=0.996 9。由圖5和圖6可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，且吸光度值基本處于朗伯-比爾定律最佳讀數(shù)范圍。

2.5 實(shí)際平均聚合度的測(cè)定

圖5 （+）-兒茶素質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 （+）-兒茶素物質(zhì)的量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)不同劑量電子束輻照后的葡萄籽高聚原花青素樣品，在甲醇體系中采用香草醛鹽酸法顯色，測(cè)得吸光度值代入圖5標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可得質(zhì)量濃度。在乙酸體系中采用香草醛鹽酸法顯色，測(cè)得吸光度值代入圖6標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可得物質(zhì)的量濃度。結(jié)合兩者，乘以修正系數(shù)，得到平均聚合度，具體如表1所示。由表1可知，電子束輻照總劑量從0 kGy升到180 kGy時(shí)，高聚原花青素的平均聚合度由14.40降到14.12，只下降1.94%；當(dāng)輻照總劑量從180 kGy增加到270 kGy時(shí)，高聚原花青素的平均聚合度從14.12降到12.48，下降11.61%；當(dāng)輻照總劑量從270 kGy升至330 kGy，高聚原花青素的平均聚合度從12.48降到9.08，下降27.24%；再增加輻照總劑量，從330 kGy到390 kGy，高聚原花青素的聚合度不僅沒有降低，反而增加到11.07，增加21.92%，這可能是由于降解后的小分子重新聚合引起[10]。電子束輻照過程中，產(chǎn)生的活性自由基使高聚原花青素?cái)噫?，平均聚合度降低，得到分子量較低的小分子。同時(shí)，如果自由基反應(yīng)不能及時(shí)終止，得到的小分子有可能重新聚合。

3 結(jié)論

不同溶劑條件下，香草醛鹽酸法的最適合反應(yīng)條件存在差異：以甲醇為溶劑，測(cè)定原花青素質(zhì)量濃度時(shí)，香草醛甲醇溶液與原花青素甲醇溶液的體積比為4∶1，在20 ℃水浴中避光反應(yīng)20 min；以乙酸為溶劑，測(cè)定原花青素物質(zhì)的量濃度時(shí)，香草醛乙酸溶液與原花青素乙酸溶液的體積比應(yīng)為3∶1，在20 ℃水浴中避光反應(yīng)5 min。電子束輻照總劑量在0～390 kGy時(shí)，隨著劑量增加，高聚原花青素的平均聚合度先降低后升高，說明電子束輻照能夠降解高聚原花青素，但需要注意選擇合適的輻照劑量；另外，還需進(jìn)一步考察電子束輻照對(duì)高聚原花青素生物活性的影響。

表1 不同劑量電子束輻照后原花青素平均聚合度的變化